幽门螺杆菌冻存复苏、接种培养和保存流程等操作总结

引言

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）作为重要的胃部定植菌，其体外培养高度依赖严格的微需氧环境、精准的活性判断及规范的保存流程。本手册整合全球两大菌种保藏中心（ATCC与DSMZ）的权威指南，系统解析培养操作的核心步骤、技术差异与共性原则，为实验室提供标准化操作范本。

一、幽门螺杆菌（ATCC标准）培养与保存指南

核心原则：

** 微需氧环境、湿润培养、避免反复传代

1、冻存菌株复苏

解冻操作

o 将干冰运输的冻存菌，置于37℃水浴中解冻。

o 解冻后取1滴悬浮液制作湿片，通过相差显微镜观察：

典型形态：中等大小、规则弯曲的运动性杆菌（仅存活培养物可见运动性）

异常提示：球形细胞（提示老化或氧暴露导致失活）

2、接种与培养流程

（1）初代培养

o 将解冻悬液无菌转移至 3-5ml #18肉汤（胰蛋白酶大豆琼脂/肉汤）中混匀。

o 接种选择：

双相培养基（推荐）：0.6ml悬液接种于 #260斜面（TSA + 羊血，即胰蛋白酶大豆琼脂/肉汤和羊血），液体聚集的斜面底部生长最快，微需氧培养

固体琼脂平板：同时接种2块 #260平板（TSA + 羊血），微需氧培养（扩培）

对照：好氧培养（阴性对照，应无生长）

（2）培养条件

（3）生长监控

双相培养基：3天内液体区可见生长（肉眼无浑浊，需镜检确认）

平板菌落：可能需延长培养

o 镜检标准：湿片观察到弯曲运动杆菌为活性标志

3、传代与保存

（1）继代培养

o 使用液体区菌液作为接种源

o 双相培养基传代：24-48小时即可获得良好生长

（2）冷冻保存（关键步骤）

o 时机：生长达峰期（镜检活性最佳时）

o 操作：

图1. ATCC幽门螺杆菌传代与保存

# 注意事项

避免反复传代（导致活性下降）

避免暴露于空气＞5分钟

4、关键技术说明

（1）革兰氏染色改进

o 问题：传统法染色效果差

o 方案：用碱性品红替代沙黄复染

（2）失活预警标志

o 镜检见球形细胞

o 液体培养无运动性

o 好氧对照平板出现生长（提示污染）

完整技术细节参见：ATCC官网

5、逻辑梳理与要点总结

二、幽门螺杆菌 (DSMZ标准) 培养与保存指南

1、活性培养物

（1）立即传代：

收到装有液体覆盖的血琼脂斜面的活性培养物后，必须立即传代。瓶中条件不利于细菌存活（运输后常可见球形死细胞）。

（2）操作步骤：

o 完全吸弃瓶内液体。

o 用 0.5 ml 培养基（如 TSB、营养肉汤或 BHI）冲洗瓶壁。

o 将冲洗液全部转移至一块湿润的血琼脂平板上。

2、冻干安瓿

（1） 按安瓿开启规程操作

（2） 用 1 ml 培养基（如 TSB、营养肉汤或 BHI）溶解冻干粉

（3）将全部溶解液转移至一块血琼脂平板上。

3、培养条件：

（1）平板湿润： 必须使用充分湿润的平板。若平板稍旧或略干，需在每块板上加入约 1 ml 液体培养基（如 TSB、营养肉汤或 BHI），让其充分吸收（直至无法再吸收为止）。次日培养时，平板上仍应可见少量液体。

（2）培养方式： 将平板正置（皿盖朝上）放入厌氧罐中。

（3）气体环境： 厌氧罐内需使用适合该菌株的气体发生包（如弯曲菌专用包），或通入相应气体环境。

（4）温度与湿度：37°C 恒温培养，罐内需放入湿润的纸巾，以确保空气湿度充足。

4、培养状态检查：

• 培养次日，取琼脂表面液体一滴镜检（1000倍放大，相差显微镜），应可见大量活菌及活动细胞（弯曲杆状）。

5、传代与保存建议：

（1）及时分板： 若非立即用于实验，建议利用初次传代培养物多制备几块平板，以保留更多细胞。幽门螺杆菌不耐多次连续传代。

（2）保存时机： 保存细胞必须选择活力最高峰（即镜下见大量活跃运动的弯曲杆状菌时）。

（3）保存步骤：

o 若琼脂表面液体中有大量细胞，可用液体培养基适当稀释。

o 加入无菌甘油（终浓度 10%，例如加入 20% 甘油溶液）。

o 按细胞密度分装成 500 µl 或 1 ml 的小份（Aliquots），冷冻保存。

（4）保存条件：

o 推荐：-80°C 长期保存。

o 不推荐：-20°C 保存（仅可作为短期保存，最长不超过 2 个月）。

（5）复苏： 解冻后，将一份冻存物接种于一块湿润的琼脂平板上。

6、精炼总结：

（1）及时传代： 活性培养物（斜面+液体）或冻干粉安瓿收到后，必须立即处理（转移至湿润血琼脂平板）。

（2）湿润培养： 使用充分湿润的血琼脂平板，必要时添加液体培养基使其饱和。培养时平板正放。

（3）严格气体与温湿度： 37°C 下，在含特定微需氧气体环境（如弯曲菌气体包）的厌氧罐中培养，罐内放置湿纸巾保证高湿度。

（4）镜检确认： 培养次日镜检表面液体，应见活菌（弯曲杆状、活动）。

（5）保存要点：

o 仅保存高活力期（弯曲杆状、活跃运动）的细胞

o 表面液体细胞可稀释后加甘油（终浓度 10%）

o 分装小份，-80°C 冷冻保存（避免 -20°C）

o 避免多次连续传代，尽早冻存备份。解冻后整份接种于湿润平板。

7、关键强调：

• 立即处理是成功复苏和培养的第一步。

• 平板充分湿润和微需氧气体环境是培养成功的关键。

• 保存必须抓住弯曲杆状活菌期，并采用-80°C 分装保存。

三、核心共性（相同点）

四、关键差异（不同点）

终极口诀：镜检定活性，微氧是铁律；斜面启培养，平板续传承；甘油十分装，禁传代勤冻存

五、实操培养

1、培养基配制

图2. 幽门螺杆菌培养基配置

关键参数：

• 血添加温度：55℃（防止溶血）

• 血源类型：脱纤维羊血（非马血/兔血）

2、菌株复苏

操作流程：

（1）取甘油保藏菌株，32-37℃水浴快速解冻（≤3分钟）

（2）无菌操作取菌液，点种接种至2块血琼脂平板（非划线，同时可以在平板上覆盖1ml左右TSB或BHI培养基）

（3）技术注释：

• 双平板设计：冗余备份（防污染/生长失败）

• 接种方式：建议采用"滴注法"（中央滴20μl，自然扩散）

3、培养条件

将上述平板置于三气培养箱中（5%CO2，5%O2，90%N2），正置，培养24h-48h

4、结果判读

菌落特征：菌落小，边缘整齐，不透明，正面灰白色，中间凸起，表面光滑，易挑起，杆菌

图3. 幽门螺杆菌生长状态

镜检确认：革兰染色：阴性（红色）,形态：弯曲杆菌（需验证运动性）

图4. 幽门螺杆菌镜检图

幽门螺杆菌培养核心总结

幽门螺杆菌的成功培养，依赖于三大关键控制：

1. 微需氧环境精准调控

o 气体比例：5-6% O₂ + 5-10% CO₂ + 85-90% N₂，瑞典CCUG保藏中心推荐保留6-8%H2，更利于维持高湿度。

# 气体比例通过三气培养箱，或厌氧罐+气包等方法实现

o 湿度保障：培养容器内放置湿润滤纸（维持≥90% RH）

2. 培养基优化

o 基础配方：脑心浸液/哥伦比亚琼脂 + 5%脱纤维羊血（55℃添加防溶血）

o 物理状态：平板需饱和湿润（预补液体培养基）

3. 活性监控与保存

o 复苏/传代后24-48h镜检，验证弯曲运动杆菌（排除球形体）

o 冻存仅取活性峰期菌体，添加10%甘油，-80℃分装深冻

o 严控传代次数（≤3次）以防退化

操作黄金标准：

三气五氧是铁律，血板湿润莫忘记；

镜检弯杆验活性，甘油分装存深寒；

革兰染色品红替，传代不过三保力

参考文献

https://www.dsmz.de/fileadmin/user_upload/Collection_allg/Cultivation_Helicobacter.pdf #DSMZ幽门培养指南

https://www.ccug.se/ordering/revival # CCUG幽门推荐培养指南

https://www.atcc.org/products/51653  # ATCC幽门培养指南

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HZB121314_幽门螺旋杆菌 | Helicobacter pylori

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更新日期：2025-08-05

编制人：小灰

审稿人：小藻