最通用的厌氧菌固体培养基：哥伦比亚血琼脂背景概述、应用场景和配置说明
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：45 发布时间：2025-07-21 17:51:24
一、哥伦比亚血琼脂培养基概述
哥伦比亚血琼脂培养基(Columbia Blood Agar)是一种营养极为丰富的非选择性固体培养基，广泛应用于临床微生物学实验室中，用于各种苛养菌（尤其是分离自肠道的厌氧细菌）和一般细菌的分离培养。
该培养基由哥伦比亚基础琼脂，添加5%-10%的脱纤维动物血(通常为羊血或马血)制成，因其优异的营养成分和广泛的细菌支持生长能力，已成为临床细菌学检验的"金标准"培养基之一。
1、历史发展
哥伦比亚血琼脂培养基的发展可追溯至20世纪中期。传统血琼脂培养基(如营养琼脂 或 胰蛋白胨大豆琼脂添加血液)，在某些苛养菌的培养上表现不佳，促使研究人员开发营养更丰富的替代品。
哥伦比亚基础琼脂，由Oxoid公司首先开发并商业化，其名称来源于，其配方中包含了多种蛋白胨的"组合"(Columbia为"组合"之意)，而非地理名称。这种组合蛋白胨策略显著提高了培养基的营养价值，使其能够支持更多种类微生物的生长。
2、主要特点与优势
哥伦比亚血琼脂培养基具有以下显著特点：
营养极其丰富：包含多种蛋白胨(酪蛋白胰酶消化物、肉胃酶消化物、心胰酶消化物等)和酵母提取物，提供全面的氨基酸、氮源、碳源和生长因子
适用范围广：支持绝大多数临床相关细菌的生长，包括许多苛养菌如链球菌、肺炎球菌、嗜血杆菌(当与NAD和血红素合用)等
良好的溶血反应显示：便于观察细菌的溶血特性(α、β或γ溶血)，这对链球菌等细菌的初步鉴定至关重要
中性pH环境：pH维持在7.3±0.2，适合绝大多数人类病原菌生长
较低的抑制剂含量：不含选择性抑制剂，使其成为理想的初级分离培养基
金黄色葡萄球菌在血琼脂上的生长效果
二、培养基成分与配方
1、哥伦比亚基础琼脂成分
哥伦比亚基础琼脂的典型配方(以g/L计)：
| 序号 | 成分 | 含量(g/L) | 功能说明 |
|---|---|---|---|
| 1 | 酪蛋白胰酶消化物 | 10.0 | 提供氨基酸和肽类，来源于酪蛋白的胰酶消化 |
| 2 | 肉胃酶消化物 | 5.0 | 动物组织消化产物，提供氮源和生长因子 |
| 3 | 心胰酶消化物 | 3.0 | 心肌组织消化产物，富含营养和生长因子 |
| 4 | 酵母提取物 | 5.0 | 提供B族维生素、核苷酸和其他生长因子 |
| 5 | 玉米淀粉 | 1.0 | 吸收培养基中可能存在的毒性代谢产物 |
| 6 | 氯化钠 | 5.0 | 维持渗透压 |
| 7 | 琼脂 | 13.0-15.0 | 固化剂，提供固体基质 |
成分1-4已成为一种固定组合，称为“特殊蛋白胨”。
哥伦比亚基础琼脂干粉有商品化的产品出售，部分商业化产品可能还含有：
• 0.3g/L的L-半胱氨酸盐酸盐(促进厌氧菌生长)
• 0.1g/L的硫乙醇酸钠(降低氧化还原电位，利于微需氧菌生长)
2、血液添加物
哥伦比亚血琼脂通常添加5%-10%的脱纤维动物血，血液选择对培养结果有重要影响：
| 血液类型 | 优点 | 缺点 | 适用情况 |
|---|---|---|---|
| 羊血 | NAD酶活性低，V因子释放少；β溶血清晰 | 某些嗜血杆菌生长较差 | 常规细菌培养，链球菌分离 |
| 马血 | 富含X和V因子，利于嗜血杆菌 | β溶血可能不如羊血明显 | 嗜血杆菌培养 |
| 兔血 | 富含营养，利于苛养菌 | 成本高，不易获得 | 特殊苛养菌研究 |
| 人血 | 易获得(在某些情况下) | 可能含抗体、抗生素；伦理问题 | 不推荐常规使用 |
血液处理关键点：
• 必须使用脱纤维血，通过机械搅拌去除纤维蛋白，防止凝固
• 无菌采集，严格避免污染
• 储存于4°C，使用前恢复至室温
• 避免反复冻融，会破坏红细胞，影响溶血反应观察
3、添加剂（选择性添加）
根据不同的应用需求，可在哥伦比亚血琼脂中另行添加以下成分：
1. NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，V因子)：
o 浓度：15mg/L
o 用途：支持嗜血杆菌等需要V因子的细菌生长
2. 血红素(X因子)：
o 浓度：10mg/L
o 用途：与NAD合用培养嗜血杆菌
3. 抗生素组合：
o 如万古霉素(7.5mg/L)+粘菌素(10mg/L)+两性霉素B(2.5mg/L)，制成选择型血琼脂
o 用途：抑制革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌，选择性分离苛养菌
4. 补充剂：
o 维生素K1(1mg/L)和氯化血红素(5mg/L)：促进厌氧菌生长
o 半胱氨酸：降低氧化还原电位
4、与其他培养基的特性比较
哥伦比亚血琼脂与普通血琼脂比较
| 特性 | 哥伦比亚血琼脂 | 普通血琼脂(如TSA血琼脂) |
|---|---|---|
| 基础营养成分 | 多种蛋白胨组合，营养丰富 | 单一蛋白胨，营养相对简单 |
| 苛养菌支持 | 优秀(如肺炎链球菌、嗜血杆菌) | 一般，某些苛养菌生长不良 |
| 溶血反应清晰度 | 通常更清晰 | 可能较弱 |
| 成本 | 较高 | 较低 |
| 适用范围 | 广泛，特别适合苛养菌 | 常规细菌培养 |
肺炎链球菌血平板生长效果
哥伦比亚血琼脂与巧克力琼脂比较
| 特性 | 哥伦比亚血琼脂 | 巧克力琼脂 |
|---|---|---|
| 制备工艺 | 添加未溶血血液 | 加热使红细胞裂解 |
| X/V因子可用性 | 部分释放 | 完全释放 |
| 适用菌群 | 广谱，特别显示溶血 | 嗜血杆菌、奈瑟菌等 |
| 溶血观察 | 可观察α、β、γ溶血 | 无法观察溶血 |
| 选择性 | 非选择性 | 部分选择性(如添加抗生素) |
三、制备方法与质量控制
1、实验室制备流程
材料准备：
• 哥伦比亚基础琼脂干粉(商业产品)
• 无菌脱纤维羊血(5%-10%)
• 无菌蒸馏水
• 适当容器(锥形瓶或培养基瓶)
• pH计或pH试纸
• 天平、磁力搅拌器等
分步制备方法：
1. 称量与溶解
o 准确称取哥伦比亚基础琼脂干粉(通常39g/L)
o 加入适量蒸馏水(如制备1L培养基，加入约900mL水)
o 搅拌混匀，煮沸充分溶解（# 电磁炉 或 微波炉 即可）
2. 加热灭菌
o 121°C高压蒸汽灭菌15分钟
o 灭菌过程中需防止过度加热导致焦化
3. 冷却与加血
o 冷却至45-50°C，手感温热但不烫
o 无菌条件下加入5%-10%脱纤维血(50-100mL/L)
o 缓慢旋转混匀，避免产生气泡
4. 倒板与保存
o 立即倾注无菌平皿(每个90mm平皿约15-20mL)
o 室温凝固后，37°C过夜做无菌试验
o 证实无菌后，2-8°C保存，建议1-2周内使用
2、关键质量控制参数
为确保培养基质量，需监控以下参数：
| 参数 | 标准要求 | 检测方法 |
|---|---|---|
| pH值 | 7.3±0.2(25°C) | pH计校准后测量 |
| 硬度 | 适中，无碎裂 | 感官评价 |
| 无菌性 | 无污染 | 37°C孵育24小时 |
| 生长性能 | 见下表 | 标准菌株测试 |
| 溶血反应 | 清晰可辨 | 溶血性链球菌测试 |
| 水分含量 | 表面无冷凝水 | 视觉检查 |
| 测试菌株 | 接种方法 | 培养条件 | 预期结果(24-48h) |
|---|---|---|---|
| 金黄色葡萄球菌(ATCC 25923) | 划线 | 35°C有氧 | 良好生长，金黄色菌落 |
| 化脓性链球菌(ATCC 19615) | 划线 | 35°C,5%CO₂ | 良好生长，β溶血 |
| 肺炎链球菌(ATCC 49619) | 划线 | 35°C,5%CO₂ | 良好生长，α溶血 |
| 大肠埃希菌(ATCC 25922) | 划线 | 35°C有氧 | 良好生长，灰白色菌落 |
| 嗜血杆菌(ATCC 49247) | 划线(含NAD和血红素) | 35°C,5%CO₂ | 良好生长 |
3、常见制备问题与解决
1. 溶血不明显
o 可能原因：血液质量差、加热温度过高、培养基pH异常
o 解决方案：使用新鲜血液，严格控制冷却温度，检查pH
2. 培养基过软或过硬
o 可能原因：琼脂量不准确、水分蒸发过多
o 解决方案：精确称量，灭菌时防止过度蒸发
3. 污染
o 可能原因：无菌操作不当、血液或基础成分污染
o 解决方案：严格无菌技术，检查原材料
4. 表面水分过多
o 可能原因：冷凝、倒板时温度过低
o 解决方案：倒板前适当提高温度，凝固后倒置培养皿
5. 如何除氧
o 可能原因：对于严苛厌氧菌，不进行预除氧，可能培养失败
o 解决方案：培养前，将血平板置入厌氧环境静置数小时除氧，如，厌氧箱、厌氧罐、厌氧袋等
四、接种方法与培养条件
接种方法：
1. 四区划线法：
o 最常用方法，获得单个菌落
o 第一区密集接种，后几区依次稀释
o 每区之间烧灼接种环
2. 定量接种：
o 用于尿液等定量培养
o 使用校准环(1μL或10μL)取样本均匀涂布
3. 穿刺接种：
o 观察厌氧代谢特性
o 用接种针穿刺培养基中心至底部
培养条件选择：
| 培养需求 | 温度 | 气体环境 | 时间 | 适用菌群 |
|---|---|---|---|---|
| 常规有氧 | 35-37°C | 空气 | 18-24h | 大多数需氧菌 |
| CO₂培养 | 35-37°C | 5%CO₂ | 18-48h | 链球菌、嗜血杆菌、奈瑟菌 |
| 微需氧 | 35-37°C | 5%O₂,10%CO₂,85%N₂ | 48-72h | 弯曲菌、某些厌氧菌 |
| 厌氧 | 35-37°C | 无氧环境 | 48-96h | 严格厌氧菌 |
哥伦比亚血琼脂适用于接种各种临床标本：
呼吸道标本(痰、咽拭子)、伤口和脓肿标本、血液培养物转种等
五、总结与改良方向
哥伦比亚血琼脂培养基作为微生物学实验室的基础培养基，因其卓越的营养支持和广泛的适用性，在过去几十年中一直是临床细菌分离的金标准之一。其独特的蛋白胨组合配方和血液添加物提供了绝大多数临床相关细菌生长所需的营养，特别是对那些营养要求苛刻的病原体。
未来改良研究可能包括：
1. 植物源性替代品：
o 探索用植物蛋白替代动物源性成分(如大豆蛋白胨)
o 目的：减少动物成分使用，降低成本，满足特殊需求
2. 合成血液替代物：
o 开发化学成分确定的血液替代品
o 优势：批次间一致性高，避免血源性疾病风险
3. 增强型配方：
o 添加特定生长因子促进难培养微生物生长
o 如添加N-乙酰葡糖胺促进艰难梭菌孢子萌发
4. 耐药菌研究：
o 添加特定抗生素研究耐药机制
o 用于筛选和表征耐药菌株
5. 生物膜研究：
o 表面改性促进或抑制生物膜形成
o 研究生物膜相关感染的治疗策略
6. 共生微生物组研究：
o 与其他培养基配合研究微生物相互作用
o 分析临床样本中复杂微生物群落
以及环境友好型配方的开发，减少废弃物处理负担。
尽管分子诊断技术快速发展，哥伦比亚血琼脂等培养方法仍然是微生物学诊断的基石，提供活菌株进行药敏试验和深入研究。正确制备、储存和使用哥伦比亚血琼脂培养基，对于临床微生物实验室确保准确的细菌分离和鉴定至关重要。
【相关资源】
名称：哥伦比亚血琼脂培养基
货号：HZB875001
名称：脱纤维羊血
货号：HZB875645
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更新日期：2025-07-21
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编制人：冬冬 | 审稿人：小藻