化能自养氨氧化细菌的分类学、生理生化特性及保藏方法介绍（《伯杰氏系统细菌学手册》第二卷 变形菌门 Part A, Page 141-147）

前言

化能自养氨氧化细菌是一类，能够利用氨作为主要能量来源、二氧化碳作为主要碳源的微生物（生理学定义）。它们与化能自养的亚硝酸盐氧化细菌，曾一同被归类为硝化细菌科（Nitrobacteraceae）。

然而，系统发育研究表明，这两类生理学定义的细菌，在系统发育上并不构成一个统一的分类单元。

一、微生物分类特性

化能自养氨氧化细菌的分类，主要基于Winogradsky的早期研究。由于这类细菌的基础代谢途径完全相同，其分类仅能依靠形态学特征（细胞形状和超微结构）作为区分依据。

根据形态特征，氨氧化细菌被划分为五个属：

1.Nitrosomonas（亚硝化单胞菌属）：直杆状，具有外周分布的扁平状胞质内膜囊泡；

2.Nitrosococcus（亚硝化球菌属）：球状，具有外周或中心堆叠的胞质内膜系统；

3.Nitrosospira（亚硝化螺菌属）：紧密螺旋状，缺乏发达的胞质内膜系统；

4."Nitrosovibrio"（亚硝化弧菌属）：弯曲杆状，缺乏发达的胞质内膜系统；

5.Nitrosolobus（亚硝化叶菌属）：多形性分叶状细胞，胞质内膜分隔。

表1列出了用于区分化能自养氨氧化细菌各属的形态学特征。

表1. 化能自养型氨氧化细菌各属的鉴别特征

然而，这些传统分类的属，实际上代表了两个系统发育，截然不同的氨氧化细菌类群。

主要类群位于β-变形菌纲（Betaproteobacteria）内，包含两个分支（图1）：

图1. 基于近全长16S rDNA序列构建的邻接树，展示了β-变形菌纲中化能自养氨氧化细菌的系统发育关系，以及Nitrosomonas（亚硝化单胞菌属）五个重要谱系的生态生理学特征。

# 注：

Nitrosospira multiformis（多形亚硝化螺菌）原名Nitrosolobus multiformis（多形亚硝化叶菌）；

Nitrosospira tenuis（纤细亚硝化螺菌）曾用名"Nitrosovibrio tenuis"（纤细亚硝化弧菌）。比例尺代表10%的序列差异。

1.第一分支包括Nitrosomonas属的物种（6个明确谱系）和原"Nitrosococcus mobilis"（现应重新归类为Nitrosomonas属，故在"Genus Nitrosomonas"章节中列为Nitrosomonas mobilis comb. nov.）。

2.第二分支包含Nitrosospira、"Nitrosovibrio"和Nitrosolobus三个属的物种。

由于它们的16S rDNA相似度极高，Head等建议将其统一归为Nitrosospira属。Utåker等和Teske等也支持这一观点。但Teske等指出，目前该分支仅有少量可靠的16S rDNA序列数据，且已报道的序列存在多位点差异。此外，16S rRNA基因序列在相似度≥97%时无法提供可靠的系统发育信息。由于基因组整体进化速率快于保守的rRNA基因，对于近期分化的类群，仅依赖16S rDNA作为分子钟存在问题。在此高相似度范围内，DNA-DNA杂交技术能更精确解析亲缘关系。

Pommerening-Röser通过S1核酸酶技术发现：Nitrosospira、"Nitrosovibrio"和Nitrosolobus三属间显著的形态差异，在基于DNA-DNA相似性构建的系统树（图2）中得到了印证，而非16S rDNA序列树。因此，仍需进一步研究以明确这三属的系统发育关系。在最终结论达成前，建议暂时保留基于形态学的传统分类，尽管它们的系统发育差异小于Nitrosomonas属内各谱系的分化程度。

第二类氨氧化细菌属于γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），仅包含Nitrosococcus属的两个物种：Nitrosococcus oceani（海洋亚硝化球菌）和Nitrosococcus halophilus（嗜盐亚硝化球菌）。

图2. 基于DNA相似度值构建的系统树，显示了Nitrosospira（亚硝化螺菌属）、"Nitrosovibrio"（亚硝化弧菌属）和Nitrosolobus（亚硝化叶菌属）代表菌株间的系统发育关系。注：Nitrosospira multiformis（多形亚硝化螺菌）原名Nitrosolobus multiformis（多形亚硝化叶菌）；Nitrosospira tenuis（纤细亚硝化螺菌）曾用名"Nitrosovibrio tenuis"（纤细亚硝化弧菌）。

二、微生物生物化学特性

目前大多数生化研究以Nitrosomonas europaea（欧洲亚硝化单胞菌）为对象，因其可从国际菌种保藏中心获取。分子比较分析表明，所有化能自养氨氧化细菌的氨氧化系统生化基础高度保守。

2.1 氨氧化反应机制

氨氧化为亚硝酸盐的过程被公认为两步反应：

1.NH₃ + 2[H] + O₂ → NH₂OH + H₂O

2.NH₂OH + H₂O → HNO₂ + 4H⁺ + 4e⁻

第一步反应，由膜整合酶氨单加氧酶（Ammonia Monooxygenase, AMO）催化。

1.AMO操纵子在N. europaea和Nitrosospira spp.基因组中分别存在2-3个拷贝。

2.该操纵子包含两个开放阅读框，编码AMO的两个亚基：AmoA（27 kDa）和AmoB（43 kDa）。近期研究还提示存在第三个亚基AmoC。

3.AMO可被乙炔不可逆抑制，通过¹⁴C标记乙炔实验证实其活性位点位于膜结合多肽AmoA上。

4.AMO反应需消耗分子氧，其所需的两个电子可能来自第二步羟胺氧化反应。

第二步反应由羟胺氧化还原酶（Hydroxylamine Oxidoreductase, HAO）催化，在周质空间通过脱氢作用将羟胺氧化为亚硝酸盐。

1.HAO是一种多亚基多血红素酶，由三个63 kDa亚基组成，每个亚基含7-8个c型血红素和一个P460中心。

2.N. europaea基因组中存在三组HAO和细胞色素c554基因簇，其中HAO基因与细胞色素c554基因的间距不超过2.7 kb。

3.周质中的细胞色素c554是电子传递的关键分支点：羟胺氧化产生的4个电子中，2个返回AMO反应，另2个分别传递至末端氧化酶和ATP依赖的逆向电子传递链以生成还原型吡啶核苷酸。

2.2 电子传递链

电子从HAO传递至末端氧化酶的路径可能为：

路径1：HAO → 细胞色素c554 → 细胞色素c552 → 末端氧化酶

路径2：HAO → 细胞色素c554 → 泛醌/细胞色素bc复合体 → 细胞色素c552 → 末端氧化酶

此外，细胞色素P460（由3个18 kDa亚基组成的三聚体）也能催化羟胺氧化为亚硝酸盐，但其生理功能尚不明确。

2.3 底物广谱性与抑制

AMO具有广泛的底物特异性，可氧化多种非生理性底物（如CO、烷烃、烯烃、炔烃及卤代烃等）。这些化合物是氨氧化的竞争性抑制剂，其氧化反应对抑制剂的敏感性与氨氧化一致。

2.4 厌氧代谢特性

在低氧条件下，亚硝酸盐可通过反硝化作用作为羟胺氧化的终端电子受体，主要产物为N₂和N₂O。该反应由周质可溶性细胞色素氧化酶/亚硝酸盐还原酶和NO还原酶催化。

2.5 尿素利用

部分氨氧化细菌（如Nitrosospira spp.）能通过胞内脲酶（urease）水解尿素获取氨。此特性对酸性土壤中的菌株尤为重要（pH低时游离氨浓度极低）。Nitrosospira的脲酶为295 kDa多肽，Kₘ值为610 μM，且受NH₄Cl浓度抑制。

2.6 碳固定与异养限制

羧酶体（carboxysomes）是部分菌株的多面体包涵体，其核心蛋白为RuBISCO（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶），负责卡尔文循环（RPP cycle）中的CO₂固定。

尽管某些有机化合物（如甲酸、丙酮酸）可被微量同化，但因缺乏关键酶（如磷酸果糖激酶），氨氧化细菌无法进行异养生长。

2.7 γ-变形菌纲氨氧化细菌的生化特性

上述氨氧化化能自养菌的生化理论主要基于对β-变形菌纲菌种的研究。属于γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）的氨氧化细菌（如Nitrosococcus oceani和N. halophilus）虽研究较少，但其氨氧化系统与β-变形菌纲高度相似：

1.细胞色素谱（含a、b、c型及P460）一致；

2.氨氧化反应化学计量相同；

3.AMO和细胞色素P460基因序列同源性较高；

4.N. oceani同样通过RPP循环固定CO₂，并具有完整的EMP途径（除磷酸果糖激酶）和三羧酸循环酶系。

三、生境分布特性

3.1 β-变形菌纲氨氧化细菌的生态分布

化能自养氨氧化细菌的β类群（beta-group）物种分布广泛，已从多种环境中分离获得菌株。

不同物种或类群在特定生境中呈现优势或专性分布，包括：

1.酸性土壤（acid soils）

2.河流与淡水湖泊（rivers, freshwater lakes）

3.盐湖与海洋（salt lakes, oceans）

4.半咸水（brackish waters）

5.污水处理厂（sewage disposal plants）

6.岩石与天然石材建筑（rocks, natural stone buildings）

部分物种为专性嗜盐菌（obligate halophiles），部分偏好富营养（eutrophic）或贫营养（oligotrophic）环境，另一些则耐受高温或低温。

在水生环境中，氨氧化细菌常以菌团（flock）或生物膜（biofilm）形式附着存在，这种生存策略使其在氨饥饿后能快速恢复活性（无延滞期），而悬浮细胞则需经历显著延滞期。

3.2 亚群的生态谱系

Nitrosomonas属的10个已描述物种及未命名种可分为6个进化谱系（图1），各谱系对应独特的生态生理特征：

谱系1a：包含中度嗜谱系1b：重分类的"Nitrosomonas mobilis"（原"Nitrosococcus mobilis"），特性与谱系1a相似。

谱系2：盐敏感型贫营养物种（如"N. ureae"和"N. oligotropha"），具有极低的氨氧化Kₛ值且脲酶阳性（urease positive），多分离自河流、湖泊等贫营养淡水环境。

谱系3：

3a亚群：中性土壤物种（如"N. communis"），脲酶阴性；

3b亚群：富营养淡水分布的"N. nitrosa"，脲酶阳性。

谱系4：专性海洋物种（如N. marina和"N. aestuarii"），依赖盐分且脲酶阳性。

谱系5：仅"N. cryotolerans"一个海洋嗜盐菌株。

谱系6：新鉴定的海洋专性嗜盐菌群。

3.3 其他β-变形菌纲氨氧化菌的生态分布

由Nitrosospira、“Nitrosovibrio”和Nitrosolobus三属组成的第二类群，常见于未处理的贫营养土壤、山区及淡水环境。Nitrosospira和“Nitrosovibrio”菌株（但非Nitrosolobus）还可从岩石、石材建筑甚至酸性土壤（氨氧化菌中唯一）中分离。Nitrosolobus则多分布于农业土壤。

3.4 γ-变形菌纲氨氧化细菌的专性海洋分布

γ类群（gamma-group）物种（如Nitrosococcus oceani和N. halophilus）仅分离自海洋与盐湖，其严格分布与其专性嗜盐性（obligate halophily）一致。通过免疫荧光（immunofluorescence）和16S rDNA特异性引物PCR，N. oceani已在南加州湾等海域原位检出。

四、原位检测技术

特殊环境中硝化过程的描述需要对相关细菌种群有详尽了解。然而过去受限于技术手段，对天然硝化种群的原位分析一直难以深入。

4.1 传统方法的局限

最大可能数法（MPN, most-probable-number）与选择性平板分离耗时且无法区分物种。

血清分型（serotyping）需依赖纯培养菌株制备多克隆抗体。

4.2 分子生态学技术

16S rRNA基因分析：特异性PCR引物扩增16S rDNA，结合克隆测序。变性梯度凝胶电泳（DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis）分析群落多样性。荧光原位杂交（FISH, fluorescence in situ hybridization）通过种/类群特异性寡核苷酸探针直接检测细胞。功能基因靶向检测：以amoA（氨单加氧酶基因）或hao（羟胺氧化还原酶基因）为靶标。

4.3 技术挑战

近缘物种间16S rDNA序列差异微小，难以区分未培养物种。部分微生物抗裂解导致检测偏差。

4.4 解决方案

将传统方法（优势菌种分离与生理表征）与分子技术（多级特异性探针系统）结合应用，可有效解决上述问题。

五、富集与分离流程

化能自养型氨氧化菌的分离操作简便但耗时较长。富集培养需采用基础盐培养基（表2），并通过连续稀释或平板划线技术获得纯培养物。为减少接种体中的有机物或氨氧化菌生长过程中产生的有机物，富集培养物应进行多数量级的连续稀释。由于氨氧化菌世代周期较长，获得纯培养物通常需数月时间。纯培养物可通过以下方式验证：①接种至有机培养基（每升水含0.5g酵母浸粉、0.5g蛋白胨、0.5g牛肉浸膏，pH7.4；分离自盐生环境的菌株需添加NaCl）；②通过相差显微镜观察细胞均一性。

表2. 化能自养氨氧化菌的培养基配方

六、生长特性

适用于氨氧化细菌自养生长的培养基见表2。其生长速率主要受温度、培养基pH值及氨浓度调控。

最适生长条件通常为：25-30℃、pH7.5-8.0、铵盐浓度2-10mM。

由于氨是真正的能量底物，铵盐的最适浓度与培养基pH值相互制约（不同氨氧化菌亚群的氨单加氧酶Ks值存在差异，范围为0.6-158μM NH3。

氨氧化为亚硝酸盐，会导致培养基pH下降。

可采用以下方法维持pH：

①手动或通过自动pH控制器，添加10% NaHCO3（使用酚红或甲酚红作为指示剂）；

②添加碳酸钠（5g/L）或HEPES（0.01M）作为缓冲体系。

海洋来源菌种通常具有严格的钠离子需求。具体培养条件需根据研究对象进行优化。

七、菌种保藏

纯培养物应保存于添加氨源和CaCO3缓冲的基础盐培养基液体培养物中。加入甲酚红可直观显示生长状态。保藏菌种需置于室温暗处，每3-5个月转接一次。

替代方案：①液氮冷冻保藏；②不建议采用冷冻干燥法（lyophilization）保藏。

参考文献

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翻译自：Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Garrity, Berner, Creig) . Volume Two：The ProteobacteriaPart A Introductory Essays.（The Lithoautotrophic Ammonia-Oxidizing Bacteria）

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更新日期：2025-08-04

编制人：思琪    |    审稿人：小藻