微生物保藏中心技术基石：冷冻保存与真空冻干操作规程
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：100 发布时间：2025-07-11 20:31:38
引言
本文译自国际权威著作《冷冻保存与冻干保存操作规程（第二版）》（*Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, 2nd ed.*）
第1章《生物资源的长期异地保藏与生物资源中心的作用》
作为生物资源保藏单位，我们系统编译此内容旨在：
1、夯实理论基础——解析生物资源中心（BRCs）的战略价值与质量标准
2、共享国际经验——引进全球顶尖保藏机构的技术规范与管理框架
3、服务行业发展——为科研院所、生产企业提供标准化操作参考
后续更新预告
本系列将持续发布核心章节译文：
• 第2章：冷冻干燥物理机制
• 第3章：冷冻保存生物学原理
• 第5章：原核生物真空干燥与冷冻保存
• 第6章：酵母菌株的冷冻干燥
• 第7章：酵母菌株的冷冻保存
• 第8章：真菌搁板式冷冻干燥
• 第9章：真菌离心/搁板式冷冻保存技术
构建覆盖微生物保藏全链条的技术知识库
生物资源中心（biological resource centers，BRCs）的建立与维护，需严格实施可靠的保存技术及质量控制体系，确保复苏的培养物和生物样本，与原始分离时性能一致。生物资源中心类型多样，其保藏种类与目的各不相同。所有BRCs均须根据应用需求，提供符合质量标准的材料与信息，并遵循相关应用标准运作。唯有通过BRCs长期高效运作，方能解决关键的工业、生物医学及物种保护问题。这要求具备超高专业能力，通过超低温保存或冷冻干燥技术维护生物样本库，确保其长期完整性及对未来研究、开发和保护的价值。
关键词：生物资源中心；保存；微生物；细胞系；组织
1. 背景介绍
数个世纪以来，收集各类生物样本（或称之为“保藏”），始终是科学家与业余收藏者的追求。保藏最初源于人类对自然环境多样性的好奇，而近一个多世纪以来，科学家为满足分类学、传染病学及生物化学等特定科技目标，系统收集了动物、植物及微生物。首例工业用微生物菌种库，由Kral于1869年建立，此后基于实验室或野外受控条件保藏的各类菌株/物种资源库逐步发展。
生物保藏面临诸多挑战：生物体对体外环境的适应性改变、基因突变、污染及培养物意外丢失等。显然，需一种能阻断生长，以降低风险的保藏机制。
19世纪科学知识与工程能力的爆发式增长，催生了新技术，包括气体压缩液化技术，推动低温生物学领域迅速发展。人类利用超低温防止生物材料降解的实践，可追溯至数千年前，而17-18世纪的科学观察，为20世纪冷冻保存技术的突破奠定基础。这些成就最终形成了可靠的原核与真核生物保存方法，使其能以"生命悬停"状态长期存活且性状不变。细菌与真菌保存技术由19世纪至20世纪初的先驱者确立，随后Polge等（1）对动物细胞的保存研究，及Sakai（2）对植物细胞的突破性工作，成为冷冻保存技术发展的关键里程碑。随着低温生物学基础研究的深入与新方法的迭代，保存技术持续优化，现已能处理本书方案所涉的多样化复杂细胞与组织培养物。
当今的培养物保藏机构（更广义的生物资源中心）融合学术、公共服务、私营、政府及商业职能，提供重要特征明确的"种子"资源：
1、工业流程开发
2、生物检测与科学文献的参考菌株
3、分类学研究的模式菌株
4、生物多样性保护中心
本章将阐述建立并长期维护冷冻保存生物材料库的核心原则与挑战。
2. 生物资源中心的基本原则
生物材料库必须维持三大核心特性，以确保存储材料的价值：
(1) 纯度（无污染生物体）；
(2) 真实性（菌株身份准确）；
(3) 稳定性（含功能特性完整）。
纯度
对避免数据偏差至关重要。然而，某些生物体因与其他生物存在腐生共生关系（如特定原生生物、腐生真菌）无法在纯培养条件下存活，或必须依赖宿主细胞保存（如疟原虫（3）），此时纯度确认极为困难。
真实性
通常基于特定稳定的表型或基因型特征，不同生物类群标准各异。部分DNA分析技术（如多位点DNA指纹图谱、短串联重复序列分析（4））及基因测序方法（如细胞色素c氧化酶测序（5）、核糖体分型（6））提供了可跨物种应用的通用鉴定方案。
稳定性
对体外培养物而言，连续传代导致的表型与基因型漂变是严重隐患，已知病毒、病原菌及细胞系（7）长期培养后，会发生不可逆变异。
因此，BRCs须通过标准化操作，确保保藏与分发样本维持上述特性，具体措施包括：
• 为每个生物体建立主库（Master Bank）与分发库（Distribution Bank）（图1）（8）
• 实施稳健的质量控制体系，验证各库符合既定标准
图1. "主库"与"工作库"（或称"分发库"）体系示意图
每个"库"由若干容器（◯）组成，容器内封装均质混合单批次收获细胞的冷冻保存样本。建立拓展细胞库可实现平行实验中不同传代次数的培养特性检测。该库体系能确保：
1. 培养物分发至研究人员前，经历尽量少的传代次数
2. 作为工艺流程图基础，构建溯源流程与质控体系（9）
质控方案需根据培养物特性动态调整，并基于双重风险评估制定：
1. 特定培养物的历史背景
2. 同类培养物的科学认知经验（风险评估要素示例见表1）
表1 生物资源中心适用标准对照
| 特性 | 细菌菌株典型方法 | 植物种质典型方法 | 动物细胞系典型方法 |
|---|---|---|---|
| 纯度 | 肉汤/琼脂培养验证纯生长 | 肉汤/琼脂培养确认无细菌/真菌污染 | 肉汤/琼脂培养确认无菌生长 (12) 支原体检测 (12) 病毒污染检测（如电镜、分子检测、动物或测试细胞系接种）(13) |
| 真实性 | 革兰氏染色、菌落形态、生化基因分型、生化反应、核糖体基因序列 | 细胞/结构形态学、基因型、次生代谢产物表达谱、DNA基因型 (10) | DNA指纹图谱、核型分析、同工酶分析、细胞色素c氧化酶序列 (4) |
| 稳定性 | 抗生素敏感性、基因测序确认无突变 | 保持植株再生能力、次生代谢产物持续表达、无芽变现象 (10,11) | 杂交瘤抗体分泌能力、病毒易感性、核型分析 |
上述要求已被纳入培养物保藏机构的最佳实践指南。该标准规定了BRCs材料质量的最低保证基准，而优质BRCs通常执行更高标准。此外，特定细胞培养类型存在专项技术指南，部分BRCs还需遵守具法律效力的法规与伦理规范（详见表2）。
表2 细胞库建设标准体系
| 培养物类型/应用场景 | 适用标准 |
|---|---|
| 研发用途 | 国家病原体操作/防护/处置法规 国家转基因生物法规 良好细胞培养规范 (15) |
| 专利保藏生物材料 | 《布达佩斯条约》 (16) |
| 植物细胞与组织 | 国家及国际病原体进出口条例 (http://www.wfcc.info) 濒危物种贸易公约 (http://www.cites.org/) |
| 动物细胞与组织 | 国家许可证/操作流程/人员培训记录法规 国家及国际病原体与濒危物种进出口条例（参见上文） |
| 研究用人源细胞与组织 | 国家伦理获取与项目审批法规 |
| 移植治疗用人源细胞与组织 | 国家及国际伦理获取/处理/存储规范 (17) |
| 人用治疗产品生产用生物体及细胞系 | 国际细胞基质规范 (18,19) |
| 检测用生物体及细胞系 | 国际生物武器扩散管制条例 国际产品检测规范（如OECD良好实验室规范 (20)、药典专论 (http://www.usp.org/ 或 http://www.pheur.org/) |
3. 生物资源中心的长期核心价值
BRCs提供的培养物若缺乏身份、来源及特性信息，其价值将大打折扣。培养物保藏机构作为重要的生物信息存储库，可通过直接联系各机构获取数据。随着BRCs培养物研究成果的持续发表，该信息资源库将不断扩充。
BRCs同时致力于培养物保藏技术的研发创新，且常为此类专业研发的唯一基地。因此，BRCs已成为生物安全、样本运输、特征鉴定、保存技术及分类学等前沿信息的权威来源（参见www.wfcc.info），并积极推动相关领域的培训教育。
众多BRCs通过保存濒危植物组织（第12章）、种子（第13章）及动物配子与胚胎（第21-23章），为生物多样性异地保护提供关键服务。这类中心具备再生已灭绝物种的潜力。生物技术与生物医学领域同样依赖活性细胞的长期存储，以确保产品生产与检测的可靠种子资源。此外，长期存储对知识产权保护至关重要——通过支持专利应用（要求保存细胞至少维持30年活性（16,21））实现技术确权。
4. 确保长期存储成功
4.1 经验与关键问题
普遍认为生物体在液氮中成功冷冻保存后，将在超低温下无限期维持活性。本书多位作者援引文献证实：冷冻保存生物体可成功存储数十年（表3）。但该结论基于存储温度稳定维持液氮温度（–196°C） 的前提。实际上：
• 气相存储无法达到此温度
• 液氮液位波动导致温度变化
核心警戒值：存储温度不可超过
➤ 冷冻细胞悬液的熔点
➤ 玻璃化材料的玻璃化转变温度（参见第2-3章）
反复短暂暴露于环境温度，将导致活性丧失。
因此，需通过以下措施，保障长期活性：
✅ 定期检查液氮液位与罐体填充计划
✅ 实施人员标准化培训 (18)
表3 保存生物材料长期活性实例
| 生物分类/材料 | 保存方式 | 存储时长 | 活性表现 | 参考文献 |
|---|---|---|---|---|
| 细菌 | 5–35年（长期） | 存活，活性无衰减 | 22 | |
| 19株酵母菌 | LN | |||
| 酵母 | FD | >30年 | 存活，活性良好 | 第6章 |
| 真菌 | FD | 24 | ||
| 粟酒裂殖酵母 | LN | 10年 | 基因型未改变 | 第7章 |
| 多种微藻 | LN | >20年 | 活性无衰减 | 25 |
| 多种蓝细菌 | LN | >20年 | 活性无明显丧失 | Rippka（个人通讯） |
| 莴苣种子 | LN | >10年 | 活性未丧失，半衰期约3400年 | 26 |
| 干细胞 | LN | 15年 | 高复苏率 | 27 |
| 人与绵羊红细胞 | LN | 12年 | 功能无退化 | 第20章 |
| 人造血干细胞 | LN | 14年 | 保留植入潜能 | 28 |
| 牛精子 | LN | 37年 | 运动力正常，成功受精 | 29 |
| 人精子 | LN | 5年 | 质量无统计学下降 | 30 |
| 人精子 | LN | 21年 | 成功受精并活产 | 31 |
| 犬胰岛 | LN | 6个月 | 胰岛素分泌无减少 | 32 |
| 绵羊胚胎 | LN | 5年 | 活产率与存储2周组无差异 | 33 |
| 绵羊胚胎 | LN | 13年 | 活产率与存储1月组无差异 | 34 |
缩写：FD, 冷冻干燥；LN, 液氮存储
4.2 存储设施
细胞库建设需匹配安全、洁净、稳定的存储环境，并保障人员安全 (15)。安全管理体系包括：
| 措施 | 功能 |
|---|---|
| 权限管控 | 限制非授权人员访问 |
| 液氮罐报警系统 | 实时监测异常 |
| 填充维护规程 | 标准化操作文档化 |
存储模式选择需权衡：
| 存储方式 | 优势 | 风险 |
|---|---|---|
| 液相存储 | 温度最低最稳定（理论最优） | 病原体交叉污染风险 (35) |
| 气相存储 | 操作便利安全性高 | 温度波动风险 |
| 电气冰箱 | 免维护实用性强 | 频繁存取导致温度扰动 |
特别警示：
• 液氮操作需专业培训（冻伤、安瓿爆炸、窒息风险）
• 密闭空间需配备个人氧气监测仪
• 危险物/隔离物/归档物分区存储
4.3 存储材料信息化
精准记录是高效检索的基础，对转基因/感染性材料更是法定要求。建议：
• 选用可定制化商用数据库系统
• 存储现场，实时更新存取记录（避免转录错误）
• 定期备份电子数据与纸质副本
4.4 长期存储其他问题
污染防控：
• 定期清理液氮罐冰泥（微生物污染源）(36)
• 采用安瓿双重密封或存储盒防护
• 警惕液氮中容器破损导致的致命病毒交叉感染 (35)
辐射影响：
自然辐射虽被视为潜在风险，但维护良好的液氮罐中长期存储（即使对胚胎等敏感系统 (37)）未见不良反应证据
灾备策略：
1. 重要归档材料分罐存储
2. 建立异地备份存储点
3. 在温度易波动区（如库存系统顶层）设置"哨兵库" (38)
4. 采用RFID技术 (39) 实时监测单管温度履历
注：加速热稳定性研究可预测超低温存储活性（参见第4、13章 (40)）
表4 典型冷冻保存材料的存储与运输条件
| 材料类型 | 存储条件 | 运输条件 |
|---|---|---|
| 冷冻干燥蛋白质、细菌、真菌 | 通常≤4°C存储（取决于热稳定性） | 可常温运输（取决于稳定性） |
| 冷冻保存细胞/生物体（瓶装或安瓿） | 通常<-100°C存储： • 电气冰箱（-100至-150°C） • 液氮液相/气相（-160至-196°C） *注：-80°C存储活性随时间递减（41）* | 干冰包装运输（-80°C） 关键：确保干冰足量维持全程冷冻 专业物流公司可补充干冰 |
| 移植用冷冻组织/细胞 | 通常液氮气相存储（避免浸没液相以防污染） | 专用"干式运输罐"维持液氮气相温度 |
| 玻璃化保存细胞（参见第3、12章） | 存储温度低于特定保存方法及细胞的玻璃化转变温度（参见第2、3章） | 必须低于玻璃化转变温度（如使用吸附液氮的干式运输罐） 干冰等较高温度会导致反玻璃化及活性丧失 |
缩写：LN, 液氮存储
5. 结论
通过专业生物资源中心（BRCs）获取经质量认证的真实生物材料与培养物，对推动科研标准化、提升效率及保障实验室安全具有显著优势。培养菌株已成为工业和生物医学工作的专业标准，且可能需稳定存储数十年，以支持物种保护计划、生产过程、检测方法及专利维护。
即使冷冻保存技术尚未针对所有待保藏生物体优化，BRCs仍面临为海量菌株提供低温存储的挑战。随着细胞体外实验技术的发展与扩张，对保存及培养专业技能的需求日益增长，BRCs将持续作为专业咨询与培训的核心基地。
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总结
本章确立生物资源中心（BRCs）作为资源库的四大支柱作用：
| 职能维度 | 技术内涵 | 行业价值 |
|---|---|---|
| 质量中枢 | 主库/分发库三级体系 ▶ 纯度/真实性/稳定性控制 ▶ 国际标准合规（ISO/WFCC） | 保障科研数据可重复性与产业标准化 |
| 信息枢纽 | 菌株溯源数据库 ▶ 跨机构数据共享 ▶ 专利生物材料保藏（布达佩斯条约） | 支撑知识产权保护与技术创新 |
| 技术引擎 | 液氮深冷存储优化 ▶ 气相/液相风险管控 ▶ 哨兵库监测 ▶ RFID温度追溯 | 破解海量菌株长期活性维持难题 |
| 物种方舟 | 濒危生物冷冻保护（种子/配子/胚胎） ▶ 灭绝物种再生潜能 | 履行生物多样性保护国际责任 |
实践启示：
• 超低温存储，需建立灾备三防线（分罐存储+异地备份+拓展库）
• 微生物保藏优先选择冷冻干燥（常温存储）与液氮气相（安全存取）
• 质量体系必须覆盖全生命周期（采集→存储→运输→复苏）
本章为后续微生物保藏技术（第2、3、5-9章）奠定核心方法论基础，敬请关注专题更新。
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更新日期：2025-07-11
编制人：小灰 | 审稿人：小藻