冷冻保存与冻干保存的操作规程_02：真空冷冻干燥原理

引言

本文译自国际权威著作《冷冻保存与冷冻协议（第二版）》（*Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, 2nd ed.*）第2章《冷冻干燥原理》。冷冻干燥（冻干）是一种通过升华去除水分，以保持生物材料活性的关键技术，广泛应用于疫苗、细胞及生物资源的长期保存。

本章系统阐述了冻干的核心原理与工艺流程，从水分去除的物理机制（如升华与干燥阶段）、冻干机设计要点（如真空系统与冷凝器配置）到冻干产品的稳定性影响因素（如温度、湿度与活性气体）。通过分阶段解析初级干燥与次级干燥的差异、升华界面的动态特性及冻干过程中可能引发的样品损伤机制（如冰晶形成、溶质浓缩与蛋白质聚合），本章揭示了冻干技术对生物活性维持的复杂作用。同时，针对冻干产品的复溶性能、配方优化（如保护剂选择）及设备操作规范进行了深入探讨，为生物资源中心在异地保藏中的冻干应用提供了理论支撑与实践指导。

细菌和真菌保藏方法

摘要

本章系统阐述了冷冻干燥（冻干）技术的最新研究进展，重点探讨该技术在工业规模活体细胞与病毒稳定化中的应用价值，特别是在疫苗制备与种子培养领域的产业化应用。文章深入分析了冻干处方设计、工艺周期开发、过程验证等关键技术环节，并着重强调实现药品监管规范要求对冻干产品商业化推广的重要意义。

关键词：冷冻干燥；冻干技术；冻干保护剂；二次干燥；升华作用

1 介绍

水是生命存在的基础，其作为通用溶剂为细胞内的生化活动提供介质，使新陈代谢得以持续进行，维系所有生命过程。简而言之，当水分子缺失时，生命活动将终止，活体细胞进入死亡或休眠状态，细胞提取物的生化反应则受到抑制。水分子同时是物质降解的关键因素，其存在可能诱发自溶作用，或促进腐败微生物的增殖（1）。

因此，为实现活性物质的稳定保存，必须对储存样品中的水分，进行固定化处理或含量降低。疫苗及其他生物材料、微生物可通过冷藏，或冷冻实现短期稳定，但维持样品冷冻状态的储存运输成本高昂，且制冷设备故障可能导致珍贵产物的完全损毁（2）。

另一种干燥技术是采用高温气流干燥，但传统热干燥过程常因高溶质浓度效应或热失活作用，导致产物物理化学性质发生显著改变，仅适用于食品等低价值产品的脱水处理。冷冻干燥技术通过整合冷冻与干燥优势，可获得干燥、活性稳定、具良好复溶性的终产品（3,4）。

1.1 冷冻干燥的定义

"冷冻干燥"（freeze-drying）与"冻干技术"（lyophilization）描述的是同一工艺过程。后者"lyophilization"原意为"溶剂亲和"，较之直译的"冷冻干燥"缺乏描述准确性。该技术可操作性定义为：通过真空干燥实现活性物质可控脱水的工艺方法。

早期冻干工艺研究强调冰晶仅通过升华作用去除，并将此阶段定义为初级干燥（primary drying），随后通过二次干燥（secondary drying）完成工艺周期。尽管这些定义适用于理想体系，但对于冷却时形成非晶态基质或玻璃态的典型体系而言，该描述存在局限性（5）。

从技术角度，冷冻干燥可定义为以下四阶段：

• 液态样品降温，可冻结水分转化为冰晶；可结晶溶质发生结晶，不可结晶溶质与未冻结水分形成非晶态基质。

• 真空条件下冰晶的升华作用。

• 非晶态基质中水分的"蒸发"过程。

• 冻干饼中化学吸附水分的解吸附作用。

1.2 历史沿革

该技术应用可追溯至史前时期，阿兹特克人与因纽特人曾用于食品保存。19世纪80年代末期，实验室规模的冻干工艺已具雏形并掌握基本原理。直至20世纪30年代，为应对热敏性抗生素与血液制品的加工需求，结合当时制冷与真空技术的进步，工业化冻干设备得以开发，并逐步在食品与制药工业实现规模化应用（3,6）。

相较于其他稳定化技术，冻干工艺具有显著优势，可归纳为以下标准（6）：

1.3 冻干产品分类

根据产品特性可分为以下类别：

• 非生物制品：用于反应性或热敏化学物质的脱水或浓缩

• 非活性生物制品：主要应用领域，包括酶制剂、激素、抗生素、维生素、血液制品、灭活/减毒疫苗等治疗或诊断用药品

• 外科/医用骨组织及其他人体组织、感官特性要求高的食品、工业生物制品

• 微生物：疫苗或种子培养用，需在复水后增殖的生物体

• 特殊应用：如水灾书籍修复、博物馆文物保存等

但以下材料不适宜冻干处理：

• 含油量或糖分过高，导致无法冻结的介质

• 易形成致密表层阻碍水蒸气迁移的制品

• 真核细胞需添加特定保护剂才能耐受冷冻，可能与冻干工艺不兼容

2 冷冻干燥工艺流程

2.1 工艺流程描述

为便于理解，冷冻干燥过程可分为以下独立步骤（7,8）：

• 预处理阶段：细胞或其他生物制品需经过疫苗制备、提取、纯化等前处理，并在适宜培养基中配制成可冻干的悬液。

• 样品冷冻：通过冷冻降低产物热变性风险，固定溶液组分并防止真空抽气时产生泡沫。冷冻过程还能在样品内部形成理想的冰晶结构，促进后续干燥效率。

• 初级干燥（升华）：维持干燥腔内条件使样品中冰晶持续迁移并升华。此阶段需严格控制样品温度（准确而言为冻干界面温度）低于共晶温度、玻璃化转变温度、崩解温度或熔点温度，以最大限度减少干燥损伤。

• 次级干燥（解吸）：通过解吸作用，去除已干燥结构中残留的吸附水分。

• 密封保存：干燥终了时在真空或惰性气体环境中密封样品，阻隔氧气、二氧化碳等反应性气体及潮湿空气的侵入（需注意冻干制品具有极大的干燥表面积，对空气变性或水分再吸附极为敏感）。

• 储存运输：完成冻干的产品经卸料、储存及分发，在注射、应用或复苏前进行复水处理。

2.2 工艺原理

冷冻干燥是一个复杂的动态过程：同一批次中各单元样品的干燥速率存在差异，导致部分区域仍处于冷冻状态，而另一些区域已完成或正在进行干燥。

精确的冷冻与干燥行为取决于样品温度、搁板温度、系统压力、产品干燥程度及工艺周期内干燥条件的动态变化。

尽管常被视为温和的干燥方式，冻干本质上可能对生物制品造成损伤。需将各工艺阶段视为相互关联的应力系统，每个环节均可能损害敏感生物产物。前处理阶段的损伤可能在后续步骤中加剧，甚至看似微小的工艺变更（如更换容器）都可能导致成功工艺失效（8）。

冻干工艺无法逆转配方前已存在的损伤，因此需审慎选择细胞类型及培养、纯化技术。配方设计的核心目标在于最小化冻干损伤，维持细胞存活率及活性。为确保活性损失最小化，样品可能需用含特定保护剂的培养基稀释，这些添加剂需针对产品或应用场景专门筛选。尽管常被称为"保护剂"，这些成分可能仅在特定工艺阶段有效，且在干燥周期其他阶段可能失效甚至与工艺不兼容。需特别注意的是，某些损伤在干燥阶段可能呈隐性表现，直至复水后才显现。因此配方中添加剂的筛选与配伍至关重要，其重要性将在后续章节详述（1,9-12）。

理想的冻干产品应满足以下标准：

• 最小化工艺导致的结构改变

• 干燥彻底

• 活性保持稳定

• 储存稳定性

• 清洁无菌（适用于药品）

• 符合伦理要求

• 具备药学美观性

• 复溶迅速，且操作简便

• 工艺具备经济可行性

产品配方需确保批次间一致性，同时满足特定应用场景要求。

2.3 样品冷冻

作为冻干工艺的初始步骤，配制完成的产品必须在，干燥腔体抽真空前，完成冷冻以启动升华过程（13,14）。

冷冻过程具有以下核心作用：

• 固定液相：防止真空抽气时产生泡沫

• 抑制热失活：降低分装后产品的活性损失

• 调控冰晶结构：形成的冰晶形态将决定冻干过程的水蒸气迁移效率，及最终冻干物的微观结构。简而言之，冷冻阶段形成的冰晶结构，直接决定后续冻干行为及干燥产物的最终形态

理想状态下，冷冻应最小化溶质浓度效应，使所有组分空间分布，与初始分装溶液保持一致。

然而，典型溶液或悬液在冷冻过程中难以实现该理想状态。针对水溶液或悬液的冷冻过程，需同时考虑溶剂（水）与溶质的物化特性。

1、冷却与冷冻的概念区分

术语"冷却"与"冷冻"常被错误混用，导致工艺理解偏差。需明确区分搁板/产品冷却与冷冻过程：

• 冷却：指冻干机搁板、导热流体、瓶体托盘、腔体内部，及分装溶液/悬液的温度降低过程。该过程不涉及物相变化，专指冻干初始阶段的温度调控

• 冷冻：特指水冻结成冰时的突变相变过程。除复杂生物大分子或低温敏感细胞外，未发生相变的冷却（冷藏）通常不会对生物材料造成损伤

2、过冷现象

溶液或悬液冷冻时，可能在达到实测冰点后，仍持续降温而不立即形成冰晶，这种现象称为过冷（undercooling/subcooling）。过冷程度受冷却速率、样品组成与洁净度、分装体积、容器类型，及冷却方式等多重因素影响。

即使对同一样品重复冷却/升温循环，过冷起始点与程度仍会呈现显著波动。在过冷状态下，虽然溶液组分未改变，但低温液态物质处于热力学不稳定状态，对冰晶形成高度敏感。随着温度持续降低，冰晶结晶概率将显著增加。优化冻干工艺时，应通过诱导过冷现象，实现样品内部均匀的冷却与冻结（15-17）。

3、冷冻过程定义

样品冷冻是悬液突变为冰晶与溶质浓缩物混合体系的过程。

该过程包含两个阶段：

• 冰晶成核：水分子初始形成晶核

• 晶体生长：冰晶在溶质相中扩展，最终形成冰晶与浓缩溶质的混合物

常规工艺条件下，冰核在悬液中的微观颗粒表面非均匀成核。通过降低温度并搅动过冷悬液，可增加冰核与水分子簇的接触概率。成核效率取决于悬液/溶液中颗粒杂质的数量与物理特性。冰晶本身是高效的成核位点，低温生物学家常主动引入冰晶种子诱导成核。其他有效成核促进剂包括玻璃碎片及特制成核促进剂。

尽管成核助剂可用于实验体系，但在药品生产中人为添加冰晶诱导剂将违反《药品生产质量管理规范》（GMP）（18）。

4、冰晶生长调控

与成核过程相反，冰晶生长（增殖）可通过升温降低悬液粘度而促进。当温度低于玻璃化转变温度（Tg′）时，冰晶成核与生长均受抑制；而高于熔点温度（Tm）时，悬液/溶液将发生熔融。这些参数的测量与影响评估是配方开发的重要组成部分（14,18,20,21）。

5、冰晶结构优化

为促进干燥过程中水蒸气的有效迁移，冰晶应具备大尺寸、宽间距及连续性特征，形成从产品基底，延伸至表面的优化结构。

冻干过程中常见的冰晶形态包括：

• 枝晶结构：冰晶从成核位点连续分支扩展

• 球晶结构：当溶液粘度较高或冷却速率较快时，次级分支生长受抑制形成的球状晶体

6、冷却速率定义

冷却速率需根据细胞存活率，或生物大分子活性等指标定义为慢速（亚优）、快速（超优）或最优。

该定义具有模糊性，除非通过更精确的条件界定。冷却速率可按以下方式量化：

• 搁板温度单位时间降温速率

• 溶液单位时间降温速率

• 瓶内液体单位时间降温深度（mm）

2.3.1 搁板冷却速率（22）

搁板冷却速率是冻干工艺中最易控制的参数，现代研究型与生产型冻干机均配备程序化冷却功能。然而，由于搁板温度与产品实际响应存在差异，仅定义搁板冷却速率，无法完整描述产品行为。

尽管我们关注的重点是，每支西林瓶内的冷却速率，但该参数较搁板冷却更难监测，因此冻干周期通常采用程序化搁板控温而非样品反馈控制。产品/细胞悬液的冷却速率在不同西林瓶间及单瓶内部分布存在显著差异，因此通过固定位置测得的样品温度，仅能近似反映温度变化全貌。

观察搁板上多支西林瓶的冷冻模式可发现：

• 部分西林瓶从瓶底开始缓慢冷冻

• 相邻西林瓶可能经历显著过冷后瞬间冻结

这种随机冻结模式将导致：

• 瓶间冰晶结构差异

• 干燥几何形态变化

影响冷冻模式的核心因素：

• 西林瓶内冰晶形成潜力

• 西林瓶在搁板上的相对位置（暴露于局部冷/热点）

• 边缘效应：搁板外围样品受腔体壁/门传热影响

• 温度探针插入引发的冰晶诱导

• 样品冻结时潜热释放导致邻近容器升温

• 容器底部几何差异影响样品与搁板的热接触

冰晶与溶质晶体结构，对后续冻干行为具有决定性影响：

• 慢速冷冻（约0.2–1.0°C/min）形成大尺寸连续冰晶，促进高效干燥，但可能引发表面结皮抑制升华效率（见3.6.2节）

• 快速冷冻形成大量随机取向的小冰晶，嵌入非晶态溶质基质中，导致冻干困难

• 极端冷却速率（＞10 mm填充深度）难以维持最优冷却，需在工艺参数间权衡

2.3.2 冰晶结构与冷冻巩固（13）

冷冻巩固期（定义为"保持时间"）是确保样品批次完全冻结的必要阶段。然而过长的保持时间，将延长冷冻时长，并影响整体周期。

需注意：

• 误区：巩固期冰晶结构，并非静止不变

• 快速冷却形成的大量小冰晶体系，处于热力学亚稳态，相较少量大冰晶结构更不稳定

• 通过重结晶（晶粒生长），实现小冰晶向大冰晶转化的热力学平衡

重结晶影响因素：

• 瓶间随机变化

• 保持时间延长显著加剧晶体结构变异与升华效率差异

热退火工艺优化（23）：

作为延长保持时间的替代方案，热退火通过程序化控温实现更高效重结晶：

• 初始冷却：完成产品冷冻及溶质结晶

• 升温重结晶：在冷冻阶段提升产品温度，促进小冰晶向大冰晶转化（注：此阶段亦可诱导冷却难以结晶的溶质结晶，见2.3.3节）

• 终冷阶段：将产品冷却至预定保持温度后启动真空

热退火核心优势：

• 优化冰晶结构，提升升华效率

• 促进难结晶溶质的完全结晶

• 实现批次产品干燥结构均一化

• 与快速冷却联用可抑制表面结皮形成

• 形成多孔结构降低最终水分含量，提升溶解性

尽管热退火延长了冷冻阶段时长，但通过提升干燥效率可显著缩短整体冻干周期（见图1）。

实施热退火时需重点关注：

• 温度选择：避免超过共晶温度导致样品局部熔融，产生高渗溶液损伤生物分子（如疫苗等不稳定产品）

• 保持时间控制：需根据样品特性精确优化

图1. 采用不适宜工艺周期冻干的样品（样品A）与优化工艺条件的同配方样品（样品B）对比

两组样品采用相同培养基配制，填充深度达60毫米，远超冻干推荐最大填充深度10毫米。尽管商业需求常要求此类超厚填充，但会显著抑制升华效率，导致：

• 冻干周期延长

• 产品塌陷

• 溶解性下降

• 活性降低

• 储存稳定性受损

此外，此类样品常出现：

• 高水分含量

• 不合格的药学美观性

• 冻干饼断裂及随干燥进程的物理损耗（定义为烧蚀，在活疫苗或细胞毒性药物冻干中尤需关注）

样品A采用传统冷冻-干燥周期，冻干周期超过10天，伴随大量西林瓶破裂及前述缺陷。

样品B通过优化工艺实现：

• 可控冷冻：诱导利于快速升华的优化冷冻结构

• 参数调节：通过调整搁板温度（↑）与腔体压力（↓），将干燥时间缩短至3天

• 质量保障：通过将样品温度严格控制在崩解温度（Tc）或玻璃化转变温度（Tg′）以下（配方与工艺开发阶段已定义）

2.3.3 冷冻过程中的溶质行为（6,24-27）

无论冷冻模式如何，冰晶形成均会导致容器内剩余溶液发生浓缩。随着冰晶比例增加，溶质浓度相应升高。以1%（w/v）的水性盐溶液为例，浓缩效应可使溶质浓度，在完全冻结前升至约30%（w/v），此时生物分子的损伤主要源于高浓度溶质暴露，而非冰晶的直接破坏。溶质在浓缩相中的行为取决于其性质、浓度、冷却速率及培养基中各溶质间的相互作用，这些特性构成了配方开发实验的核心研究内容。

冻干过程中溶质反应的四种典型模式：

• 共晶冻结：溶质在任意冷却速率下均自发结晶，形成冰晶与溶质晶体的混合物

• 慢速结晶：溶质仅在缓慢冷却条件下结晶

• 热退火结晶：溶质需经热退火处理后才能结晶

• 非晶态残留：溶质在任何冷却速率下均不结晶，以亚稳态非晶态或玻璃态与未冻水共存

共晶点是系统中残余液相与固相达到平衡的最低温度。高于该温度时，冰晶与浓缩溶液共存；低于该温度时，形成冰晶与溶质晶体的混合物。含结晶盐的水溶液共晶温度具有特征性，显著低于水的冰点（如氯化钠共晶温度为-21.4℃）。细胞或蛋白质长期暴露于高渗盐浓度的共晶溶液中，可能因质壁分离或"盐析"作用导致损伤（28）。

共晶区指系统内所有共晶温度的区间范围。对于两组分水/溶质体系，共晶温度是明确的量化值；而在多溶质体系中，共晶区表现为一个温度范围，其最低共晶温度低于培养基中任一单溶质的共晶温度。

典型冻干疫苗配方在冷却时往往无法完全结晶，部分溶质以非晶态玻璃态残留。当暴露于玻璃化转变温度（Tg′）或崩解温度（Tc）以上时，样品在升华过程中可能升温，导致非晶态基质软化，引发冻干饼塌陷形成粘稠无定形残留物（20,29-33）（见图1）。轻度塌陷将导致冻干饼收缩、变形或开裂。

塌陷不仅影响外观，还会导致：

• 溶解性下降

• 活性降低

• 储存稳定性受损

表面结皮的形成会加剧塌陷，阻碍水蒸气迁移。为避免塌陷，需在初级干燥阶段始终将升华界面温度控制在Tg′或Tc以下，并在配方中添加可减轻塌陷的赋形剂。因此，在工艺开发阶段必须通过实验对配方进行表征。虽然塌陷可能造成冻干操作困难，但诱导并维持非晶态对于保护不稳定生物分子在冷冻、干燥及储存过程中的完整性至关重要（23,34,35）。

2.3.4 实际冷冻方法

根据操作需求，样品可采用多种方式冷冻：

3 水分去除过程

3.1 升华与干燥（34）

在常压条件下，液态水通过加热转化为蒸汽的过程称为蒸发。然而，水的三相（冰、液态水、蒸汽）在三相点共存的现象表明：在减压条件下，冰可直接通过升华转化为蒸汽。冰晶从冷冻样品中升华后，会形成开放的多孔干燥结构，溶质在空间分布上保持原溶液或悬液的排列特征。与干燥过程中组分持续浓缩的蒸发过程不同，真空升华最小化了浓缩效应，可获得活性高且易溶解的干燥产物。

完成溶液冷冻后，下一步是通过直接升华冰晶生成水蒸气实现样品干燥。为维持冻干条件，必须将水蒸气分压降至三相点以下（0℃时约800 mBar），以确保冰直接转化为蒸汽并防止样品熔融。真空系统具有双重作用：

• 降低样品上方空气浓度以促进升华

• 排除渗入系统的空气

3.2 升华速率与腔体压力条件

将腔体压力降至0.8 mBar以下可通过降低样品上方气体/蒸汽浓度来减少水分子迁移阻力，从而提升升华速率。当压力降至约1 mBar时，升华速率达到峰值。进一步降低系统压力反而会降低升华速率，这一看似矛盾的现象可通过以下机制解释：

• 压力降低：稀释腔体气氛以促进蒸汽迁移

• 热传导需求：系统需保留足够的气体分子以实现搁板向样品的热传导。高真空条件下，腔体产生类似保温瓶的绝热效应，抑制热传递。在高压（真空度差）条件下，热传导主要依赖气体/蒸汽传导；而在高真空条件下，热传导效率下降，热量主要通过辐射传递（相对低效机制）。

工业与研发型冻干机通常通过以下方式恒定腔体压力以优化热传导：

• 向腔体/冷凝器/真空系统通入空气

• 隔离真空泵以增加腔体水分子数量

两种方法效果相当。需注意：通过通气提升干燥速率并非通过"吹扫"作用移除水分子（36）。

3.3 蒸汽压差与干燥效率（36,37）

维持冻干过程，需要建立从样品（高压）→冷凝器→真空泵（低压）的压力梯度，以驱动水蒸气迁移。尽管样品温度需高于冷凝器以确保净蒸汽迁移，但系统驱动力本质是**蒸汽压差（VP）**而非温差。例如：

• 样品温度-20℃（VP=0.78 torr）

• 冷凝器温度-40℃（VP=0.097 torr）

→ 驱动力=0.78-0.097=0.683 torr

将冷凝器降温至-70℃（VP=0.002 torr）仅能提升驱动力至0.778 torr（+13.8%）。该示例表明：提升样品温度比降低冷凝器温度更能提升升华效率。因此，在配方开发中选择允许使用较高工艺温度的赋形剂对优化冻干周期至关重要。

3.4 热量与质量传递（36,37）

冻干过程的核心在于平衡冰晶升华转化为蒸汽与蒸汽从冻干物料中移除这两个过程。为维持升华，需向产品供热以补偿升华冷却效应。但需精确平衡：

• 供热量：维持升华速率

• 蒸汽移除量：避免温度过低降低效率或过高引发熔融/塌陷

这一平衡通过热质传递方程定义。在升华初期，干燥结构对蒸汽流动阻力小，平衡易维持。随着干燥层增厚，蒸汽迁移阻力增大，若不降低工艺温度，样品可能升温导致熔融或塌陷。降低能量输入虽会减缓干燥速率并延长周期，但这是保证样品质量的必要妥协。

3.5 产品的冷却与加热（7,14,22）

冻干机搁板承担双重功能：

• 冷却功能：初始冷冻样品

• 恒温/加热功能：干燥阶段提供升华所需能量

常见两种控温系统：

• 直冷系统：搁板内置独立冷却管路与加热元件，通过交替运行控温。成本低但控温精度仅±5℃

• 硅油循环系统：工业级设备采用硅油循环，通过独立冷热交换器维持±1℃精度，符合GMP要求

热传递效率取决于：

• 产品性质（填充深度、粘度等）

• 样品容器尺寸与几何结构（是否直接接触搁板）

• 冻干机设计

• 腔体真空条件

产品温度可通过调节搁板温度或系统压力（改变热传导效率，见3.1节）控制。无论采用何种系统，均可通过手动或PC/微处理器编程控温。

3.6 干燥周期

为清晰说明，通常将干燥周期分为初级干燥（升华阶段）和次级干燥（解吸阶段）。

3.6.1 初级干燥

干燥周期的第一步定义为初级干燥，即样品中70-90%的冰转化为水蒸气的阶段。尽管升华效率较高，但初级干燥时长取决于配方特性、冻干饼厚度等参数。在此阶段，样品以升华界面为边界，从表面向底部逐步干燥。

3.6.2 升华界面（7,8,14,32,33）

又称干燥前沿，宏观上可观察到该界面从冷冻样品顶部向底部移动，形成逐渐增厚的干燥层。热量通过西林瓶底部从搁板传导至升华前沿，驱动冰晶升华。该过程引发以下关键效应：

• 冷冻区低温维持：升华冷却效应保持冷冻区低温

• 传质阻力增加：干燥层增厚导致蒸汽迁移阻力上升，升华速率下降

• 结构塌陷风险：升华界面是温度与湿度变化最剧烈区域，易发生软化或塌陷

• 水蒸气再吸附：升华前沿逸出的水蒸气可能重新吸附至干燥层

监测挑战：由于升华界面持续移动，传统温度探针难以有效监测其温度。对于理想共晶配方，界面表现为清晰边界；但疫苗等典型非晶态配方的升华前沿更宽泛，冰晶分散于非晶相中，蒸汽需穿透逐渐干燥的非晶相迁移，导致升华速率显著低于共晶模型预测值。此外，冰晶间裂隙可提升干燥效率，而表面结皮等系统阻力因素均需在配方开发中综合考量。

工艺优化要点：尽管初级干燥机制复杂，仍可通过以下措施提升效率：

• 搁板温度：在避免塌陷/熔融前提下，采用尽可能高的温度加速升华

• 系统压力：维持高真空以优化热传导

初级干燥结束时，疫苗虽外观干燥，但水分含量仍高达7-10%，需通过次级干燥进一步脱除残留水分。

3.6.3 次级干燥

与高蒸汽流速的初级干燥不同，次级干燥效率较低：占总周期30-40%时间，仅脱除5-10%水分。此阶段样品接近稳态，水分通过解吸/吸附与环境湿度、搁板温度动态平衡：

• 促进解吸：提高搁板温度 + 高真空条件（降低系统蒸汽压/湿度）

• 促进吸湿：降低搁板温度 + 升高系统蒸汽压（如升温冷凝器）

风险提示：次级干燥虽不易塌陷，但若样品温度超过玻璃化转变温度（Tg），仍可能引发干燥基质塌陷。

3.6.4 产品封口

冻干产品具有强吸湿性且暴露表面积巨大，暴露于大气环境将导致吸湿和氧化降解。建议在冻干机内完成封口：

• 真空封口：最小化反应性气体，确保产品稳定性

• 防泡措施：全真空状态下注水易引发泡沫，可通过封口前充氮气缓解

4 产品复溶

通常认为由于冻干仅去除水分，因此所有产品只需加水复溶即可恢复全部活性。

实际情况可能并非如此：冻干产品在等渗介质（如生理盐水）中复溶时，常比纯水复溶表现出更高的活性。

5 冻干机设计

为实现冰直接升华的工艺需求，冻干机需在低压条件下运行，这增加了设备复杂性和成本。样品腔必须承受真空与大气压之间的压差。尽管合适的真空泵可初始抽真空并排除渗入空气，但其无法持续移除升华产生的水蒸气，因此需在样品与泵之间设置制冷捕水阱（工艺冷凝器）以冷凝迁移的水分。实际上，冷凝器构成了系统的"抽气动力"。

冷凝器类型对比：

材料与灭菌要求：

• 材质：研究或生产型冻干机通常采用不锈钢制造，因其可耐受蒸汽等多种消毒剂清洗

• GMP灭菌：需通过加压蒸汽灭菌，进一步增加设备复杂性和成本，因其需满足真空与加压双重工况要求

现代功能配置：

• 内置封口装置：实现冻干周期结束时西林瓶在线封口

• 阀门与监测系统：实时评估干燥效率

• 计算机/微处理器控制：确保工艺可重复性与法规验证需求

疫苗冻干特殊要求：

需配备安全防护装置与工艺规程，确保操作安全并防止产品交叉污染

6 冻干过程中的样品损伤

冻干产品损伤可能发生于以下阶段：

• 降温阶段（冷冲击）

• 冷冻阶段：冰晶形成与未冻浓缩

• 干燥阶段：样品塌陷

• 次级干燥：高温导致蛋白质聚合

• 干燥与储存：活性气体（如氧气）损伤

• 储存阶段：自由基损伤或美拉德反应

• 复溶阶段：溶解性差导致损伤

6.1 冷冲击损伤

在无冰晶形成条件下降温通常对生物分子或活体无害，但敏感生物大分子可能因冷冲击受损（39）。

6.2 冷冻损伤（9,28）

冰晶形成条件下的降温是对生物分子的首次重大应力。冰的直接损伤通常不显著，除非活细胞快速冷冻导致胞内冰晶形成。

生物分子更易受以下冷冻效应损伤：

• 冰晶形成（40）

• 溶质浓缩：1% NaCl溶液冷冻浓缩后可达30%（41）

• 溶液张力变化（42）

• 溶质聚集：细胞与生物分子易聚集（43,44）

• 盐析效应：高浓度电解质导致蛋白质沉淀（43）

• 缓冲盐差异结晶：溶液pH剧烈变化（44）

• 毒性杂质富集：超过毒性阈值（44）

• 二硫键破坏

• 缺氧环境形成

7 影响冻干产品的因素

冻干疫苗需通过配方设计最小化储存衰变，并应具备耐受常温运输的能力。

然而，认为冻干产品在储存过程中，完全免受损伤的观点是错误的，以下因素均可能导致产品损伤：

• 温度：尽管冻干产品比液态产品更稳定，但仍对热敏感，储存温度直接影响稳定性（45）

• 水分含量（46–53）

• 活性气体（54）

• 光照

• 自由基损伤（55）

• 背景核辐射

• 特定化学反应（如美拉德反应）（56）

关键关系网络：样品配方、冻干饼水分、储存条件与玻璃化转变温度（Tg）之间存在复杂关联。

通常，冻干饼在储存期间发生物理变形时，活性损失速率，远超通过阿伦尼乌斯方程预测的液态样品（21,29,32,33,57–59）。

7.1 悬浮介质组成对活细胞冻干存活的影响

单纯用水或简单盐溶液冻干细胞通常导致存活率低下。已开发多种保护介质用于冻干疫苗保存，包括强化培养基或糖溶液：

糖类保护剂特性对比：

关键发现：

• 糖类选择应基于实验验证的冻干特性，而非经验判断

• 盐类添加会显著降低糖溶液的Tg′/Tc（1,3,20,23,31,58,60）

• 非晶相的重要性：虽然可能导致塌陷，但非晶态基质是稳定疫苗和活细胞的关键，通过整合保护剂与生物分子减少损伤

总结

第二章全面解析了冷冻干燥的技术原理与关键工艺环节，强调了其在生物资源长期保藏中的核心价值。冻干通过控制升华与干燥阶段的热力学平衡，实现水分高效去除并维持样品结构完整性，但需兼顾设备设计（如冷凝器类型与真空条件）、配方优化（如糖类保护剂选择）及工艺参数（如温度梯度与压力调控）。同时，冻干产品的稳定性受多重因素影响，包括储存环境（温度、湿度）、活性气体侵袭及化学反应（如美拉德反应）。本章通过理论分析与实例对比，明确了冻干技术在保障生物材料活性、延长储存周期中的优势与挑战，为生物资源中心的标准化冻干操作及质量控制提供了科学依据。未来研究需进一步探索新型保护剂开发与智能冻干设备优化，以提升冻干工艺在生物资源异地保藏中的普适性与可靠性。

参考文献

微生物保藏中心技术基石：冷冻保存与真空冻干操作规程. https://www.huizaobio.com/article/a343.html # 参见第一章末尾

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更新日期：2025-07-20

编制人：小灰    |    审稿人：小藻