固氮微生物背景介绍及其固氮作用机制

引言

微生物固氮是指常温常压下，固氮微生物通过体内固氮酶的催化作用，将大气中游离的分子态N₂，还原为 NH₃的过程。N₂占空气体积近 80%，N≡N 键非常稳固，动植物和大多数微生物都不能直接利用 N₂。某些微生物能通过细胞内酶系的作用将 N₂转变成 NH₃。能完成这一过程的唯一生物类群是原核微生物。生物固氮是极重要的生物氧化反应，为所有生物生长提供必不可少的还原态氮，与农业生产关系密切。

一、固氮微生物背景介绍

固氨微生物包括细菌、放线菌和蓝细菌等原核微生物，共有200余属(截至2006年统计)。有自养菌，也有异养菌，有光能营养型，也有化能营养型；有好氧菌、厌氧菌，也有兼性型。

据估计，全球每年的生物固氮量约两亿吨，超过工业氮肥总量。其中共生固氮量占 65%~70%。

据研究，每亩豆科植物每年固氮量达 16kg(大气氮)，相当于施用 30~80kg 硫酸铵。固氮菌是土壤中的正常菌群，也是水环境和植物表面如根表及叶面的正常菌群。

据其生态类型，可将它们分为三个类群(表6-3)。

固氮微生物分类

1.自生固氮微生物

自生固氮微生物能独立固氮，在固氮酶作用下将 N₂转化成NH₃,不释放到环境中，进一步合成氨基酸，组成自身蛋白质。只有当固氮微生物死亡后，通过氨化作用才被植物吸收。它的固氮效率低。自生固氮微生物的种类很多，包括好氧、兼性厌氧和厌氧的各个类群。

自生固氮微生物中,好氧的以固氮菌属较重要,固氮能力较强,每消耗1g有机物可固氮10~20mg;厌氧的以巴氏固氮梭菌较重要，固氮能力较弱，每发酵1g有机物只能固定1~3mg 氮。

圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)是最常见的自生固氮菌，专性好氧，幼龄细胞呈杆状，后变为圆形。细胞英膜较发达，常成对排列，呈“8”字形，有时4个细胞连在一起，产生非水溶性黑色素。在阿须贝无氮琼脂培养基上，菌落圆形，边缘整齐，黏稠，由最初无色透明、表面光滑逐渐转为白色，以后转为褐色、产生皱褶，最适生长温度为 25~30℃。在菜园土中可以分离到。圆褐固氮菌可利用不同的糖、醇、有机酸为碳源。供给适当的氮化物(如NH₃、尿素、硝酸盐等)时它就不固定N₂，直接利用氮化物。它们能形成多种维生素类物质，对植物生长有一定的刺激作用。

2.共生固氮微生物

共生固氮微生物一般需要，与其他种生物共生，才能固定N_2，或者才表现旺盛的固氮作用。与自生固氮微生物相比，共生固氮微生物有更高的固氮效率。以与满江红共生的满江红鱼腥藻，与豆科植物共生的根瘤菌较重要。满江红是一种蕨类植物，鱼腥藻生活在满江红同化叶片共生腔里，稻田养萍可以增产就是利用满江红鱼腥藻的固氮作用。据计算，满江红每公顷养殖面积每年满江红鱼腥藻可固313kg;与豆科植物共生的根瘤菌每公顷每年能固定150~300kg氮，并且能将约90%固定的氮供植物利用。所以，农业上栽培豆科植物(如种植绿肥紫云英等)常作为养地的一项重要措施据统计，根瘤菌固定的氮约占生物固氮总量的40%。

在培养条件下，根瘤菌为杆状，革兰氏阴性，快生型周生鞭毛，慢生型单生鞭毛，无芽孢。在根瘤中的形态有的仍为杆状;有的种类逐渐改变，常呈“X”“Y”“T”形，称类菌体。类菌体只能长大，不能分裂，也不能在一般培养基上生长。根瘤菌与豆科植物共生有专一性，种根瘤菌只能在一种或几种豆科植物上形成根瘤，形成互接种族。种豆科植物施用根瘤菌肥料应选择相应的根瘤菌制剂。

根瘤的形成从根瘤菌侵入宿主的根毛开始，根瘤菌侵入根毛细胞并繁殖。根毛分泌纤维质物质包围根瘤菌形成套状的侵入线。随着根瘤菌的繁殖带状侵入线不断伸长，最后到达皮层深处刺激皮层细胞分裂,使皮层加厚形成根瘤。根瘤中有新分化的输导组织与植物输导组织相通皮层细胞里的根瘤菌加速分裂、膨大形成类菌体。随着含根瘤菌的皮层细胞的形成，类菌体的胞膜中出现红色的豆血红蛋白，根瘤成熟并开始固氮。有效的根瘤含有丰富的豆血红蛋白运输固氮所需能量和物质。

3.联合固氮微生物

联合固氨微生物是一类必须生活在植物根际、叶面或动物肠道等处才能固氮的微生物，如产脂固氮螺菌、雀稗固氮菌(Azotobacterpaspali)。它们既不同于共生固氨微生物(不形成根瘤等特殊结构)，也不同于自生固氮微生物，它们有较强的宿主专一性，并且固氮作用比在自生条件下强得多。近年来在甘蔗、玉米等作物中发现多种内生固氨菌，定殖在植物内部固氮，对宿主无不良反应。

二、固氯作用机制

1966 年，Mortenson 等从固氮菌细胞抽提液分离到固氨酶，解开固氮的生化和遗传机制。

生物固氨反应的五要素

生物固氮反应的五要素如下：

（1）固氮酶及其作用的厌氧条件。固氮酶由两部分组成，组分I即钼铁蛋白(MoFd)是真正的“固氮酶”，它直接作用于N₂，使其还原成NH₃，是固氮核心；组分Ⅱ即铁蛋白(AzoFd)，实质上是一种“固氮酶还原酶”，它主要起传递电子的作用，是活化电子的中心。固氮时必须两种组分结合在一起才能起作用。固氮酶的两个组分都对氧高度敏感，遇氧分子则发生不可逆的失活;高浓度的氧，对固氮酶的合成有抑制作用;氧可氧化电子载体使电子无法到达固氮酶。固氮作用只能在厌氧条件下进行。现已发现有的固氮菌的固氮酶中，钼的作用可由钒或铁代替。

（2）ATP的供应。N≡N分子存在三个共价键，将1分子的 N₂还原成2分子的NH₃时需要消耗大量的 ATP。这些能量，厌氧微生物来自糖的酵解，好氧微生物来自有氧呼吸，光合微生物来自光合磷酸化。

（3）还原力(H)及其传递载体。固氮反应需要大量还原力，以NAD(P)H+H⁺的形式提供，还原力由低电势的电子载体铁氧还蛋白，或黄素氧还蛋白传递至固氮酶。所需的电子供体来自，有机物的分解或水的光解(如蓝细菌等)。丙酮酸是重要的电子供体和能量来源。

（4）还原底物——N₂

（5）镁离子

固氮作用的生化过程

各类固氮微生物固氮作用的基本反应相同。

N2+6H++6e−+nATP⟶2NH3+nADP+nPiN2+6H++6e−+ATP⟶2NH3+ADP+Pi

固氮生化过程可分为两个阶段(图1)

图1 微生物固氮的生化途径(A)及其细节(B)

1.固氮酶形成阶段

固氮酶钼铁蛋白有三种状态:

氧化态、半还原态和完全还原态;

铁蛋白有两种状态:

氧化态和还原态。N₂还原成NH₃需要接受6个电子，由电子供体(如丙酮酸)传至电子载体 Fd 或 Fld,再由电子载体向氧化态的铁蛋白的铁原子提供一个电子使其还原。还原态的铁蛋白与ATP-Mg结合后改变构象。钼铁蛋白在含钼的位点上与分子氮结合，并与铁蛋白-Mg-ATP 复合物反应，形成1:1复合物——固氮酶。

2.固氮阶段

固氮酶分子上有一个电子从铁蛋白-Mg-ATP 复合物转移到钼铁蛋白的铁原子，铁蛋白重新变为氧化态，同时ATP水解为ADP+Pi,通过连续6次电子转移使钼铁蛋白放出2分子NH₃。实际上还原1分子N₂要用8个电子，理论上只需6个电子,有2个电子消耗在产H₂其原因尚不清楚，不过有证据表明H₂的产生是固氮酶反应机制中不可分割的组成部分。固氮酶也能催化 2H⁺+2e^-→H₂反应，缺N₂时可将H⁺全部还原为H₂释放;有N₂时只将75%的H⁺用于还原N₂，25%的H⁺还原为H₂。大多数固氮菌中还有氢化酶能将释放的激活回收一部分还原力H⁺和ATP。

NH₃是固氮作用的产物，它与相应的 α-酮酸结合生成各种氨基酸。例如，与丙酮酸结合生成丙氨酸，与a-酮戊二酸结合生成谷氨酸等。氨基酸再进一步合成蛋白质等。NH₃能阻遏固氮基因的转录，使固氮酶不能合成。缺乏NH₃时谷氨酰胺合成酶处于非腺苷化状态，具有催化和调节功能，能与固氮酶启动基因结合，推动RNA聚合酶催化转录mRNA，合成固氨酶；NH₃丰富时谷氨酰胺合成酶被腺苷化，构象改变，不能与固氨酶启动基因结合，固氮酶不能合成。因此，生成的NH₃如不及时转化，或施用过多的氮肥，使NH₃超过一定浓度便抑制固氮作用自生固氮菌的固氮作用和NH₃的同化在同一细胞内进行。共生固氮菌的固氮作用在类菌体中进行，产生的 NH₃穿过类菌体膜，其同化由根瘤细胞质中的酶系催化完成，其产物绝大部分转运给宿主特别是地上部分。蓝细菌异形胞固定的分子态氮以酰胺的形式传递给周围的营养细胞。只有在C/N高时才发挥其固氮作用

固氮过程中固氮酶，必须始终受防氧保护机制的保护。丝状蓝细菌有特殊结构，固作用在异形胞中进行，其细胞壁厚，不受环境中和邻近细胞产生的氧的影响，它本身不进行光合作用不产生氧气，呼吸强度高，加上脱氢酶和氢化酶活性高，使细胞内保持高度的还原状态。其中超氧化物歧化酶活性高，有解除氧毒害的功能，所以它具备固氮作用所需的还原性条件。无异形胞的蓝细菌有的通过将固氮作用与光合作用分别在夜晚黑暗和白天光照下进行以保护其固氮酶;有的通过束状群体中央处于厌氧环境下的细胞失去能产氧的光合系统Ⅱ，以便进行固氮作用;还有的通过提高过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性除去有毒过氧化物。根瘤菌靠类菌体膜上的豆血红蛋白向类菌体提供低浓度和高流量的,豆血红蛋白与分子氧有很强的亲和力。通过氧化态(Fe³⁺)和还原态(Fe²⁺)间的变化可以调节氧的浓度。好氧性自生固氮菌则利用呼吸保护和构象保护组成防氧保护机制，呼吸保护是以较强的呼吸作用迅速消耗掉固氮酶周围的氧气;构象保护是在氧分压高时，其固氮酶能与一种耐氧的铁硫蛋白质Ⅱ结合形成耐氧复合物，其固氮酶能形成无固氮活性又可防止氧损伤的特殊构象，一旦氧浓度降低，此蛋白质便从酶分子上解离，固氮酶又恢复原有的构象和固氮活性。

固氮酶对底物的专一性不高，HCN和C₂H₂,等化合物都可以被固氮酶还原。1966年，Dilworth和Scholhorn等分别发表了既灵敏又简便的乙炔还原法测定固氮酶的活力。乙炔被固氮酶还原成乙烯，乙烯很容易用气相色谱法测定。而且该反应有高度的专一性，没有其他的酶能催化这一反应。测定时只要将待测菌悬液放在含 10%C₂H₂空气(好氧菌)或10%C₂H₂,氮气(厌氧菌)的密闭容器中，经适当培养后，按不同时间用针筒抽取少量气体至气相色谱仪测定即可获得固氮酶活性的准确数据。此方法灵敏度高、设备简单、成本低廉、操作方便，已广泛用于固氮酶活性的测定。

生物固氮能提高土壤肥力。长期以来人们一直重视利用其固氮特性。现已制成根瘤菌剂、联合固氮菌剂等各种固氮菌剂用于农业生产，增产效果显著。固氮菌对铁和钼敏感，在缺钼、缺铁的土壤中施用钼肥可提高其固氮效果。所以，固氮菌剂要注意与钼肥、磷肥和有机肥等肥料配合施用。我国的固氮微生物资源调查及分类研究进展较大，接近国际先进水平，但微生物固氮肥料发展还比较迟缓，深入研究固氮菌的固氮分子基础，以提高微生物的固氮水平;利用基因重组技术有可能构建固氮能力更强的新菌株;通过DNA重组技术改造共生细菌，提高其竞争力，使其能超越天然共生细菌，促进根瘤的形成等。完成这些工作需要借助现代生物工程,尤其是酶工程和现代发酵工程。

参考资料

蔡信之,黄君红,康贻军.《微生物学(第四版)》.北京:科学出版社,2023.

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更新日期：2025-06-17

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