ATCC真菌处理指南02_保存篇

真菌保存指南

大多数酵母和真菌，可以制备为冷冻干燥的培养物（冻干粉），或液氮冻存（低于-130°C）保存多年。

相比于传代保存，冻存优势明显，包括：

安全性：设备故障或交叉污染风险更低

节省成本：非常用菌株维护的时间和金钱成本降低

变异风险低：避免遗传不稳定性，或选择压力导致，长期传代引起表型变化

标准程度高：同批次菌种的表型特征几乎一致，适合作为对照实验的标准工作菌种

ATCC真菌指南

低温保存

通常情况下，冷冻会导致菌体存活率下降。当悬液冷却至冰点以下时，形成冰晶，溶质浓度增加产生不利渗透压力。此外，胞内冰晶可能导致细胞结构受损。如果冷却过程中允许胞内水分通过渗透逸出，这一影响可以最小化。

缓慢冷却（每分钟-1°C至-10°C）有助于降低影响。随着细胞失去水分，它们会缩小体积，如果超过最小阈值体积，会迅速丧失活力。加入保护剂（甘油或二甲基亚砜DMSO）可以减轻这些影响。对于真菌培养物的保存，建议使用甘油作为冷冻保护剂。

将含有保护剂的培养物缓慢冻结，直到温度降至-70°C以下，然后转移至液氮中。冻存物恢复需要在25-30°C的水浴中迅速解冻，然后将其转移到适当的培养基。

真菌和复苏的影响因素很多，包括冻存物的成分、菌株生长阶段和菌体浓度等。为了获得最佳存活率，应针对性修改低温特殊菌株的操作手法，确保在对数生长期冻存。

液氮保存

冷冻保护剂

甘油和DMSO是最常见的冷冻保护剂。ATCC建议使用20%甘油溶液配置，终浓度为10%。然而，如果菌株对甘油敏感，可以使用50%DMSO，最终浓度为5%。一般来说，甘油可以高压灭菌，而DMSO必须过滤灭菌。

处理DMSO溶液时应小心，它会迅速穿透皮肤，并带有毒性。使用试剂级DMSO或甘油，两者都应分装并避光保存。总体而言，最佳配方仍需通过经验确定。

冷冻设备

材料选择：玻璃或塑料。玻璃瓶更难操作，需要使用前灭菌，高温熔封。对于高价值菌种的长期保存，首选玻璃安瓿。ATCC种子库使用玻璃瓶存储，放置在液氮罐底层。工作库使用塑料冻存管、双层玻璃安瓿和血清瓶。

塑料瓶：塑料瓶有内部螺纹和硅胶垫圈，以及外部螺纹两种类型。内螺纹瓶最早商用，但与外螺纹相比有一些缺点，如果密封太紧或太松，冻存管会泄漏。

控制速率的冷冻室

实现每分钟-1°C冷却速率。最优方法是可编程的电子冷冻设备（如Thermo Scientific CryoMed Freezers）。这种设备相对昂贵，但对于敏感的菌株来说是必要的。

另一种是冻存物放入降温盒，置于-70°C或更低冷却24小时。市面上有商业可用的冷冻室，或者可将冻存管放入聚苯乙烯盒，壁厚15毫米，容量1升，盒内填充棉花或泡沫。

液氮冷冻储存

可通过专用冰箱或液氮维持长期储存的超低温（低于-130°C）。将冻存管浸入液相或悬挂在气相中，液相容纳更多的氮气，维护较少，但有可能渗漏爆炸，推荐使用气相。

气相在容器内垂直温度梯度。底部液氮的温度为-196°C，顶部的温度则取决于底部液氮的量和容器打开的时间。为了确保安全储存，应保持容器内足够的液氮水平，使顶部的温度达到-130°C或更低。所有储存系统都应配备温度报警装置。

低温冻存程序

培养菌株 按推荐条件培养，直至对数生长期。

加入冷冻保护剂 向悬液中加入适量冷冻保护剂。

分装 取0.5-1.0 mL混合物分装到冻存管或玻璃安瓿，安瓿融封后要消毒。

缓慢冷冻 放入预冷（4°C）的控制速率冷冻室，并将冷冻室放入机械冷冻机中，温度设定为-70°C（或更低），至少冷冻24小时。或者，使用预冷（4°C）的可编程冷冻单元，设定为以每分钟-1°C的速度冷却，直至温度降至-40°C以下。

转移 迅速转移到液氮或-120°C超低温冰箱。

记录 记录样本位置和详细信息。

活性测试 在-120°C下存放24小时后，取出一个样本，确定活性和纯度。

冻存物复苏

快速解冻 快速解冻冻存管，立即将其转移到适当的培养基中。一些真菌从低温保存中完全恢复，可能需要更长的时间。

准备培养 准备一个包含10mL培养基容器，该培养基已平衡温度和pH值。

解冻 从液氮冷冻机中取出冻存管，并在25-30°C的水浴中轻轻摇动解冻（或设定为该菌株的正常生长温度）。迅速解冻，直至所有冰晶完全融化（大约5分钟）。

消毒 将冻存管从水浴中取出，70%乙醇消毒，严格遵守无菌操作。

转移 打开瓶盖，将培养物转移到培养基。

检查 适当时间后，检查培养物。

液氮保存

冻干法（Lyophilization）

冻干通过升华，去除样本中的水和其他溶剂液体，将其直接转变为气态而不经过液相。冻干制备的样本较为稳定。过程分为三步：预冷冻形成冻结结构、初次干燥去除大部分水分、二次干燥去除结合水。

在初始冷冻过程中，冰晶开始形成，悬浮液中的溶质浓度增加。使用较慢的冷却速率是有利的，因为这会形成垂直的冰晶结构，从而使得水分升华更加高效。

冻干物储存时必须防潮。此外，这些产品对氧气含量和温度的变化敏感，这会显著缩短其保质期。因此，冻干材料应储存在能够保护产品免受潮湿和氧气暴露的条件下，并在冷藏温度（4°C）下储存。

冻干装置

对于真菌的冻干，ATCC使用商用冻干机。在此冻干过程中，样品与合适的保护剂混合，分装到安瓿中，然后缓慢冻结成固体。在冻干机（如VirTis® Genesis Pilot Lyophilizer，Millrock Technology® Max85 Freeze Dryer）中冻干。

初次干燥阶段，通过真空泵将水分从冻结的产品中升华，并通过冷凝器收集。冷凝器必须低于产品温度，温差决定升华速率。初次干燥后，加热样本去除残留水分。在二次干燥阶段，残留水分含量须降至1%或更低。此过程需要低压和低温冷凝系统。干燥后，融封安瓿储存在4°C。

为了保存最大菌体活性，培养物冻干前须处于最佳状态。菌株生长期会影响其冻干后的存活能力；例如，从对数后期或早期静止期收获的酵母菌株在低温应力下的存活机会最大。同样，使用适当的生长条件，营养性非选择性培养基，也有助于菌体活性恢复。

冻干程序

培养菌株 按照推荐程序培养菌株。

混悬 选择恰当的冻干添加剂，充分混合。

分装 将悬液分装到血清瓶中。用带孔的硅胶塞轻塞住，然后将安瓿放在冻干机托盘上。在塞子上放一块有机玻璃板。

缓慢冷冻 缓慢冷冻样品。

冻干 使用冻干机冻干。在-30°C下保持18-48小时，具体时间取决于添加剂。然后以每小时10°C的速度提高搁板温度，直至产品温度达到25°C。

密封 当循环完成后，用无菌氮气回填系统并压紧盖子。消毒安瓿外表面封口

冻干物复苏

复溶 加入0.3至0.4 mL肉汤或无菌水，复溶冻干菌株

混合 充分混合后，转移到含有5至6 mL肉汤培养基的试管中

接种 可以将少量悬液转入斜面或平板，使用生长培养基帮助菌体活性恢复

培养 使用推荐温度和气体条件培养菌株

真菌保存

酵母可以低温冻存或冻干保存：

培养 在琼脂上培养菌株

混悬 用20%脱脂牛奶或Reagent 18洗脱菌体制备悬液冻干，或10%甘油制备悬液冻存。必要时可刮取琼脂平板表面。

Reagent 18： 0.75 g 胰酪大豆肉汤， 10 g 蔗糖， 5.0 g 牛血清白蛋白V级， 100 mL 蒸馏水， 通过0.2 µm滤膜过滤灭菌

分装 充分混合后，每个内瓶（双瓶法）分装0.2 mL，或每个塑料瓶分装0.5 mL用于冻存。

控速降温 按一般程序进行冻干或控速冷冻。

产孢丝状真菌

产孢真菌一般使用冻干法保存：

培养 培养真菌，确保产生足够的孢子能经受冷冻和干燥过程。最佳培养基和生长温度可以在说明书上找到。

准备添加剂 准备20%脱脂牛奶，在4°C下储存，确保使用时牛奶是冷的。

制备孢子悬液 慢慢将约2 mL牛奶加入培养管或平板中，同时用移液管轻轻刮取表面。注意避免产生气溶胶，尤其是对于青霉菌、曲霉菌等干燥孢子。链孢霉孢子非常难以控制，其冻干通常在250mL烧瓶中培养。

转移 将悬液转移回剩余的脱脂牛奶中，充分混合。如果使用多个平板或培养管，重复此过程并将悬液汇集在一个培养管；需要至少10⁶个孢子/mL的浓度。

时间控制 孢子在液体中会萌发，因此冻干时间至关重要。孢子在脱脂牛奶中不应超过两小时。

分装 每个冻存管分装0.2 mL用于冻干。

复溶 用0.5至0.9 mL无菌水复溶冻干的真菌培养物，然后转移到6 mL水中。浸泡至少2小时后再转移到固体培养基。

不产孢丝状真菌

含有菌丝的培养物应在试管内的琼脂上培养，用移液管刮取后悬浮在10%甘油中。此悬液应分装成0.5 mL的等份，每个塑料管分装一份，并使用缓慢冷冻法保存（见注释5）。

注释5：对于粘性菌丝、不易破碎的菌丝或在琼脂中嵌生生长的菌丝，可以在琼脂平板上培养这些菌株。使用无菌的软木塞打孔器切取包含新生长（菌丝尖端）的琼脂块。将三到四个琼脂块放入每个塑料冷冻管中，每管加入约0.4毫升10%的甘油，然后使用控制冷冻法保存。

注意事项

注意污染、孢子分散、处理和储存过程中玻璃安瓿破裂、打开玻璃安瓿时冻干材料的分散以及液氮处理。为了防止污染和材料分散，必须遵循无菌技术。这包括所有设备和试管的消毒，以及在生物安全柜中进行准备工作。此外，准备过程中应穿戴防护服，以防止污染并保护接触液氮时的伤害。

参考资料

https://www.atcc.org/resources/culture-guides/mycology-culture-guide

【相关资源】

名称：致病疫霉 | Phytophthora infestans

菌株编号：HZB446344, CBS 120920

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更新日期：2024-11-21

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