燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测方法
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：123 发布时间：2024-11-06 14:49:39
燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测方法
1范围
本文件描述了应用全基因组单核苷酸多态性(wgSNP)方法对燕麦嗜酸菌西瓜亚种进行潮源检测的方法。
本文件适用于燕麦嗜酸菌西瓜亚种的分子溯源检测。
2规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1溯源traceability
对于一个未知产地的对象,依靠建立特定的技术,实现其原产地的追溯
注:溯源又称为“可追溯性”。
3.2系统发育树phylogenetic tree
具有共同祖先的各物种间进化关系的树。
注:在进化树中,每个分支节点代表其各分支的最近共同祖先,而节点间的线段长度对应演化距离,
3.3单核苷酸多态性single nucleotide polymorphism:SNP
在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性
3.4全基因组单核苷酸多态性whole genome single nucleotide polymorphism;wgSNP
在全基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，
4病菌的基本信息
中文名:燕麦嗜酸菌西瓜亚种,又称瓜类果斑病菌、西瓜细菌性果斑病菌、西瓜细菌性果腐病菌
学名:Acidovorax avenae subsp.citrulli(Schaad et al.,1978)Willems et al.,1992
最新命名:Acidovorax citrulli(Schaad et al.)Schaad et al.，2008
异名:Pseudomonas avenae subsp. citrulli(Schaad et al.,1978)Hu et al., 1991
Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al., 1978
分类地位:原核生物界(Procaryotae),变形菌门(Proteobacteria),8-变形菌纲(Betaproteobacteria),从毛单胞菌科(Comamonadaceae),酸菌属(Acidovorax),西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)。
该病菌的其他相关资料见附录A。
5方法原理
燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测方法的原理是通过全基因组测序技术发掘物种的wgSNP位点,基于得到的单核苷酸多态性信息构建系统发育树,进行聚类分析,从而对物种进行溯源归类。
6仪器和器具
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压灭菌锅、PCR 扩增仪,冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、电泳仪、凝胶成像系统、-20 ℃冰箱、水浴锅、解剖刀、离心管、镊子、移液器、冻存管、培养皿、酒精灯、接种针。
7试剂和培养基
试剂:70%酒精、CTAB、PCR Tag酶、PCR Tag 缓冲液、dNTP、无菌超纯水。
LB液体培养基:1L ddH,O中,加入胰蛋白胨10.00g,酵母浸粉5.00g,氯化钠5.00g,搅拌至完全溶解后,每份10m分装到玻璃试管中。
LB固体培养基:1LLB液体培养基中,加入16.00g琼脂粉,分装至锥形瓶中。
以上培养基均在高压灭菌锅中121℃高压灭菌20min,备用。
8溯源检测方法
8.1检测流程
对燕麦啫酸菌西瓜亚种进行溯源的流程包括菌株的活化、DNA的提取与纯化,全基因组测序,数据评估质控、序列比对、SNP检测、系统发育分析以及结果判定。检测流程见附录B。
8.2菌株活 化
在超净工作台环境中,将保存的菌株用LB固体培养基用接种针取菌采用平板培养皿上划线法活化,于28℃恒温培养箱中倒置培养2d~3d备用。
8.3 DNA 提取与纯化
使用CTAB法或商业DNA提取试剂盒,对基因组DNA的提取方法见附录C,提取后通过PCR扩增仪对其进行PCR扩增,并用电泳仪对PCR产物进行电泳,最后使用凝胶成像系统进行检测。用核酸蛋白检测仪测定DNA浓度及纯度后,保存于-20℃冰箱备用。
8.4全基因组测序
以模式菌株(REF)或来源明确的菌株的全基因组序列为参考基因组,采用全基因组鸟枪法(WGS),利用测序仪对构建的PE(Paired-End)文库进行2X150bp测序,测序有效深度(SequencingDepth)应达到 200X,即测序所得到的碱基(bp)总量与待测物种基因组(Genome)大小的比值应达到 200。
8.5数据评估质控
对待测物种测序的原始数据(rawreads)通过通用生物信息分析软件进行质量评估。然后通过通用生物信息分析软件进行质量剪切,确保得到的数据有效、准确。
8.6 序列比对
按照通用生物信息分析软件列出的流程开展序列比对:
a)使用通用生物信息分析软件将待测物种基因组有效数据与参考基因组(8.4)进行比对;
b)使用通用生物信息分析软件转换比对结果的格式，并对其排序;
c)统计比对结果;
d)使用通用生物信息分析软件进行重复序列的标注(MarkDuplicates);
e)根据比对结果进行冗余序列(duplicate reads)分析、插入片段长度(insert size)的分布等分析;
f)利用通用生物信息分析软件进行深度覆盖率统计分析
8.7 SNP检测
利用通用生物信息分析软件的识别单倍型(HaplotypeCaller)算法分析待测物种基因组和参考基因组之间的基因型差异,对待测物种的SNP进行分析,得到变异信息并统计变异位点。
8.8系统发育分析
将待测物种的全基因序列单核苷酸多态性位点按相同顺序串联起来,得到一条fasta序列(参考附录D),然后将每个菌株等长的fasta序列输入到建树分析软件,再通过系统发育树邻接法(NJ法)基于wgSNP构建系统发育树,对菌株(含参考菌株)进行亲缘关系分析。
9结果判定
根据待测物种序列在系统进化树上与已知来源的燕麦嗜酸菌西瓜亚种的分支聚集结果进行判定:如果待溯源物种与已知来源物种序列聚为一支,支持率为100%,即可判定待溯源物种与已知溯源物种具有相同的来源地;如果待湖源物种与已知来源物种序列聚为一支,支持率低于100%,即可判定该物种与已知湖源物种疑似为相同的来源地;如果待溯源物种未与已知来源物种序列聚为一支,则判定该物种与已知溯源物种不是同一来源地。
10样品与原始数据保存
10.1 样品保存
分离得到的菌种转移至LB液体培养基,在恒温摇床中28℃培养36h,加人20%灭菌甘油,置于-80℃条件下保存至少12个月或采用无菌水保存法,严格防止扩散,保存期满后,经高温高压灭菌处理
10.2结果记录保存
完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和审核人员签字。PCR产物凝胶电泳检测需有电泳结果照片,测序全基因组序列需要保存电子文件。
附录A(资料性)基本信息
A.1分布
亚洲:中国、印度尼西亚、伊朗、以色列、日本、马来西亚、韩国、泰国、土耳其。
欧洲:希腊、匈牙利、意大利、荷兰、塞尔维亚。
北美洲:加拿大、哥斯达黎加、瓜德罗普岛、尼加拉瓜、特立尼达和多巴哥、美国
大洋洲:澳大利亚、关岛、北马里亚纳群岛。
南美洲:巴西。
A.2寄主范围
辣椒(Capsicum annuum)、西瓜(Citrullus lanatus)、甜瓜(Cucumis melo)、罗马甜瓜(C.melovar. canatalupensis),香瓜(C.melo var, makuwa),网纹甜瓜(C.melo var, reticulatus),哈密瓜(C.melovar.saccharinus)、黄瓜(C.sativus)、南瓜(C.moschata),西葫芦(C.pepo)、番茄(Lycopersicon Esculentum)、胡椒(Piper nigrum)茄(Solanum melongena)。
A.3为害症状
该病害主要侵染植株的子叶、真叶和果实。子叶受到为害时,背面常出现水浸状,沿叶脉逐渐发展呈黑褐色坏死斑;真叶受到为害时,初为水浸状斑,浓绿色小点,周围逐渐形成黄色晕圈,病斑沿叶脉发展成暗棕色角斑或不规则大斑:果实受到为害时,最初果皮上出现直径仅几毫米的水浸状凹陷斑点,随后迅速扩展呈暗绿色或褐色不规则边缘的病斑,用解剖刀和镊子解剖观察,可观察病原菌可透过果皮进入果肉,有时呈孔洞状,果实腐烂,有的病斑表皮龟裂,常溢出黏稠、透明、琥珀色菌脓。
附录C(资料性)基因组 DNA 制备
C.1DNA 制备
a)使用下列CTAB方法提取病菌DN,或使用商业化试剂盒提取DN。菌株的培养及DNA制备的前处理。
1)将菌株接种于装有LB液体培养基试管中,置于恒温摇床上28℃摇培28h。
2)在试管中加人0.1mol/l磷酸钠缓冲液10m洗下菌体。
3)将细菌悬浮液转移至灭菌的离心管中,置于冷冻离心机中12000g下离心15min,弃上清液。
b)DNA 的提取。
1)在沉淀中加人TE缓冲液5mL、10%SDS溶液300L,20mg/ml蛋白酶K 30μL,混匀1)37℃置水浴锅中水浴1h。
2)加人等体积的三氯甲烷/异戊醇(24:1),混匀,10000g离心5min,将上清液转移至新的2)灭菌离心管中。
3)加人等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇(25:24:1)混匀,10000g离心5min,将上清液转移至新的灭菌离心管中。
4)加人0.6倍体积的异丙醇,轻轻混合至DNA沉淀下来,10000g离心5min,弃上清液。
5)用1ml,的70%乙醇沉淀洗涤后,离心弃乙醇,在超净工作台中晾干,加人50LTE缓冲液溶解DNA沉淀,-20℃可长期保存。
C.2DNA 浓度及纯度测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度,分别取得260nm和280nm处的吸收值,按照公式(C.1)计算DNA纯度,按照公式(C.2)计算DNA浓度:
参考文献
《GB/T 43166-2023 燕麦嗜酸菌西瓜亚种溯源检测方法》
相关资源
名称:燕麦假单胞菌|Acidovorax avenae subsp. avenae
菌株编号:HZB358370
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更新日期：2024-11-06
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编制人：木木