GB/T 5750.12-2023微生物指标-11 产气荚膜梭状芽孢杆菌
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：353 发布时间：2024-10-18 11:37:33
11 产气荚膜梭状芽孢杆菌
11.1滤膜法
11.1.1 原理
采用滤膜过滤器,用孔径为0.45μm的滤膜过滤水样,细菌被阻留在膜上,将滤膜的截留面朝下贴在 SPS培养基上,36℃厌氧培养18h~24h后,计数黑色菌落数,挑选5个可疑菌落进行证实试验。产气荚膜梭状芽孢杆菌是能够分解乳糖产酸产气,产卵磷脂酶,分解卵黄中的卵磷脂,无动力,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐的革兰氏阳性杆菌,结合证实试验结果与计数结果,计算得到100ml,样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数的方法
11.1.2 培养基与试剂
11.1.2.1 0.1%缓冲蛋白胨水
11.1.2.1.1 成分
按如下成分配制:
11.1.2.1.2 制法
加热溶解蛋白胨于纯水中,调节pH至6.8~7.2,121℃高压蒸汽灭菌15min。
11.1.2.2 亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶(SPS)琼脂
11.1.2.2.1 成分
按如下成分配制:
11.1.2.2.2制 法
将基础成分加热煮沸至完全溶解,调节pH至6.8~7.2,分装到500mL烧瓶中,母瓶250ml121℃高压蒸汽灭菌15min,于50℃士1℃保温备用。临用前每250ml基础溶液按比例加入亚硫酸钠溶液(新配)多黏菌素B硫酸盐溶液和磺胺嘧啶钠溶液,摇,倾注平板
11.1.2.3 液体硫乙醇酸盐(FT)培养基
11.1.2.3.1 成分
按如下成分配制:
11.1.2.3.2制 法
将以上成分加热煮沸至完全溶解,冷却后调节pH至6.9~7.3,分装试管,每管10ml,121℃高压蒸汽灭菌15min。临用前煮沸或流动蒸汽加热15min,迅速冷却至接种温度
11.1.2.4含铁牛乳培养基
11.1.2.4.1 成分
按如下成分配制:
11.1.2.4.2 制法
将硫酸亚铁溶于纯水中,不断搅拌,缓慢加人1000ml,牛奶中,混匀。分装试管,每管10ml.118℃高压蒸汽灭菌12min。本培养基应新鲜配制。
11.1.2.5 缓冲动力-硝酸盐培养基
11.1.2.5.1 成分
按如下成分配制:
11.1.2.5.2 制法
将以上成分加热煮沸至完全溶解,调节pH至7.1~7.5,分装试管,每管10ml,121℃高压蒸汽灭菌15 min。如果当天不用,于0℃~4℃冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热15 min,迅速冷却至接种温度。
11.1.2.6卵黄琼脂培养基
11.1.2.6.1 成分
按如下成分配制:
11.1.2.6.2 制法
制备基础培养基,调节pH至7.4~7.6,分装每瓶100ml。121℃高压蒸汽灭菌15min,于50 ℃±1℃保温备用,临用前每100ml,基础溶液按比例加入葡萄糖溶液和卵黄盐悬液,混匀,倾注平皿。
11.1.2.7 硝酸盐还原试剂
11.1.2.7.1甲液(对氨基苯磺酸溶液)
溶解 8.0g对氨基苯磺酸于1000 m乙酸溶液[c(CH3COOH)=5 mol/L]中。
11.1.2.7.2 乙液(a-萘酚乙酸溶液)
溶解 5.0 g a-萘酚于1 000 ml乙酸溶液[c(CH3COOH)=5 mol/L]中。
11.1.2.8 革兰氏染色液应符合 5.1.2.4的要求。
11.1.3仪器设备
11.1.3.1电子天平。
11.1.3.2pH计或精密pH试纸。
11.1.3.3恒温培养箱:36℃±1℃。
11.1.3.4冰箱。
11.1.3.5恒温水浴箱:46 ℃±1℃。
11.1.3.6显微镜。
11.1.3.7无菌吸管:1mL、10m或移液器
11.1.3.8无菌试管:18 mmX180 mm。
11.1.3.9无菌平皿:直径9cm。
11.1.3.10厌氧培养装置、
11.1.3.11过滤设备:配备滤器和抽滤装置。
11.1.3.12滤膜:孔径为0.45μm。
11.1.3.13无齿镊子。
11.1.4 样品
11.1.4.1污染较轻的水样,可直接取100m水样进行检验。11.1.4.2 污染严重的水样,可使用0.1%缓冲蛋白胨水将水样按10倍系列稀释,取100ml,进行检验
11.1.5 试验步骤
11.1.5.1 产气荚膜梭状芽孢杆菌检验程序
检验程序见图1。
11.1.5.2 滤膜灭菌
将滤膜放人烧杯中,加入纯水,煮沸灭菌3次,15min/次,前两次煮沸后需换水洗涤2次~3次。或使用符合要求的商用一次性无菌滤膜。
11.1.5.3 滤器灭菌
滤器经121℃高压蒸汽灭菌15min。或使用符合要求的商用一次性无菌滤器
11.1.5.4 过滤水样
先用无菌镊子夹取无菌滤膜边缘部分,将滤膜正面朝上贴放在已灭菌的滤床上,固定好滤器,将100mL水样注人滤器中,打开滤器阀门,在-5.07X10'Pa(-0.5大气压)下抽滤。每次试验均需要用100m0.1%缓冲蛋白胨水进行空白对照。
11.1.5.5培养
过滤完水样后,关上滤器阀门,取下滤器,用无菌镊子夹取滤膜边缘部分,移滤膜倒置在SPS琼脂培养基上,滤膜截留细菌面与培养基完全贴紧,避免气泡产生,然后将平皿倒置于厌氧培养装置内,于36℃士1℃厌氧培养18h~24h,计数黑色菌落数，
11.1.5.6 证实试验
11.1.5.6.1 使用无菌镊子夹住滤膜边缘,缓缓掀起,以免菌落脱落或被蹭花,翻转滤膜,使菌落生长面朝上,从滤膜或培养基上挑取上述平板上生长的5个可疑黑色菌落(小于5个时应全部挑取),分别接种于FT培养基,于36℃士1℃培养18b~24h,该培养物用于证实试验。
11.1.5.6.2 用上述培养液涂片,革兰氏染色、镜检。产气荚膜梭状芽孢杆菌为革兰氏阳性粗大杆菌,其耐热菌株可能形成卵形芽孢,位于菌体中央或近端,其宽度一般不超过菌体宽度。
11.1.5.6.3 取生长旺盛的FT培养液1mL,接种于10mL含铁牛乳培养基底部,加入1cm~2cm高液体石蜡,以隔绝氧气,于46 ℃±1℃水浴中培养2h,然后每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象,该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质,通常会上升到培养基表面。5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭状芽孢杆菌发酵乳糖,凝固酪蛋白并大量产气,呈“暴烈发酵"现象,但培养基不变黑。
11.1.5.6.4用接种针取FT培养液穿刺接种于缓冲动力-硝酸盐培养基,于36℃±1℃厌氧培养24h士2h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况,判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长,无动力的菌株沿穿刺线生长而无扩散生长。滴加0.5mL,甲液(对氨基苯磺酸液)和0.2mL,乙液(a萘酚乙酸溶液)以检查亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者,表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐;如果不出现颜色变化,则加少许锌粉,放置10min,出现红色者,表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭状芽孢杆菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
11.1.5.6.5 用接种针取FT培养液点种于卵黄琼脂平板(每个平板至少可接种10点),于36℃±1℃厌氧培养24h士2h,观察接种点的变化。产气荚膜梭状芽孢杆菌会产生卵磷脂酶,分解卵黄中的卵磷脂,接种点的底部及周围形成乳白色的浑浊带。
11.1.6 试验数据处理
11.1.6.1 产气英膜梭状芽孢杆菌的计数
对滤膜上证实为产气英膜梭状芽孢杆菌的菌落进行计数。
11.1.6.2 产气英膜梭状芽孢杆菌的计算
根据检验用样品量,按公式(12)计算出每100ml样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落数,结果以CFU/100 mL报告。
11.1.7 质量控制
11.1.7.1 培养基检验
更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验,将阳性菌株产气英膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)标准菌株CICC22949(或其他等效标准菌株)和阴性菌株生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)标准菌株CICC10385(或其他等效标准菌株)制成5CFU/100mL~100CFU/100ml,的菌悬液,若使用的是定量标准菌株,则可按照给定值直接稀释后使用,分别按照试验步骤 11.1.5.2~11.1.5.5进行操作。阳性菌株应产生黑色菌落;阴性菌株不应产生黑色菌落。其他培养基和试剂按照11.1.5.6采用阳性菌株进行验收
11.1.7.2 对照试验
定期进行阳性及阴性对照试验。将阳性菌株产气荚膜梭状芽孢杆菌和阴性菌株生孢梭菌制成5CFU/100ml~100CFU/100ml,的菌悬液,若使用的是定量标准菌株,则可按照给定值直接稀释后使用,按11.1.5的要求进行操作。阴性对照试验不应出现黑色菌落:阳性对照试验应产生黑色菌落,再经过11.1.5.6确认检出产气英膜梭状芽孢杆菌。如阴性对照或阳性对照试验结果不符合,本批次试验结果无效,应查明原因后重新测定。
参考文献
《GB/T 5750.12-2023 生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》
相关资源
名称:产气荚膜梭菌|Clostridium perfringens
菌株编号:HZB225589
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更新日期：2024-10-18
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编制人：木木