GB/T 5750.12-2023生活饮用水标准检验方法第12部分:微生物指标-贾第鞭毛虫
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：141 发布时间：2024-10-16 13:19:11
8贾第鞭毛虫
8.1免疫磁分离荧光抗体法
8.1.1原理
采用过滤和反向冲洗技术从水样中富集贾第鞭毛虫孢囊,借助免疫磁分离技术将贾第鞭毛虫孢囊从其他杂质中分离出来,再经过酸化脱磁、异硫氰酸荧光素酯/4'6-二脒基-2-苯基吲哚(FITC/DAPI)染色，最后经过显微镜检确认和计数的方法。
8.1.2培养基与试剂
8.1.2.1 磷酸盐缓冲液(PBS 溶液)
8.1.2.1.1 成分
按如下成分配制:
8.1.2.1.2 制法
上述成分混合溶解于纯水中后,用1mol/L盐酸或氢氧化钠溶液将pH调到7.1~7.3,于0℃~4 ℃冷藏保存可储存 1周。
8.1.2.2 贾第鞭毛虫/隐孢子虫免疫磁分离试剂盒
所含试剂如下:
a)抗隐孢子虫单克隆抗体磁微粒;
b)抗贾第鞭毛虫单克隆抗体磁微粒;
c)缓冲液A(15 mL);
d)缓冲液B(10m)。
免疫磁分离试剂盒，于0℃~4℃冷藏保存
8.1.2.3免疫荧光染色试剂盒
抗隐孢子虫/贾第鞭毛虫单克隆抗体-异硫氰酸盐荧光素试剂盒,于0℃~4℃冷藏保存
8.1.2.4 封固剂(2%DABCO/甘油)
8.1.2.4.1 成分
按如下成分配制:
8.1.2.4.2保存
室温条件下可储存12个月。
8.1.2.5 Tris
溶液(1 mol/L)在1000mL纯水中溶解132.2g的Tris 盐酸(CH CINO),然后再加 19.4g的 Tris 碱(C HNO,)。用1mol/,盐酸或氢氧化钠溶液将 pH 调到 7.3~7.5。用孔径 0.22μm的滤膜过滤灭菌后,移到一个无菌的塑料容器中。在室温条件下可储存6个月。
8.1.2.6 Na2EDTA水合物溶液(0.5mo/L)
将 37.22g乙二胺四乙酸二钠盐二水化合物(Na2EDTA·2H,O)溶解到200ml的纯水中,然后用1mol/L盐酸或氢氧化钠溶液将pH调到7.9~8.1,室温条件下可储存6个月。
8.1.2.7淘洗缓冲液
8.1.2.7.1淘洗液 A
按如下成分配制:
称取1.0g月桂醇聚醚-12到玻璃烧杯中,然后加100ml纯水。用电炉将烧杯加热,使月桂醇聚醚-12溶解,然后再将其转移到1000mL,有刻度的量筒中。用纯水将烧杯冲洗几次,确保所有的冲洗液都转移到量筒中。加10mLpH为7.4的Tris溶液、2mLpH为8.0的Na2EDTA 二水合物溶液和150μLA型止泡剂。最后用纯水稀释到1000mL。室温条件下可储存1个月。
8.1.2.7.2 淘洗液B
按如下成分配制:
将 1.44g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾及8.0g氯化钠加入 900ml,纯水,搅拌20 min至完全溶解,加入 0.1 mL, 吐温-20并继续搅拌10 min,然后用纯水稀释至1000mL。
8.1.2.7.3 淘洗液C
按如下成分配制:
将 0.2g焦磷酸四钠、0.3gEDTA 柠檬酸三钠加入 900ml,纯水,搅拌10 min 至完全溶解,加入10 ml, Tris-HCI(1 mol/L,)并搅拌5 min使之混合。再加人 0.1 ml,吐温-80并继续搅拌 10 min,然后用纯水稀释至1000m,并调节pH为7.2~7.6。
8.1.2.8盐酸溶液(0.1 mol/L)
量取0.1mol盐酸,缓慢加入1000m纯水中,混后备用
8.1.2.9 氢氧化钠溶液(1 mol/L)
称取1mol氢氧化钠,加人1000m纯水中,完全溶解后备用。
8.1.2.10 分析级甲醇
甲醇含量大于99.5%的分析级甲醇
8.1.2.11 DAPI储备溶液
在微型离心管中加入1mgDAPI,然后加人 500 μL的甲醇(2 mg/m)。可于0℃~4℃冷藏避光保存 15 d。
8.1.2.12 DAPI染色溶液
用50 mL PBS稀释10 μL DAPI母液,用时配制,于0℃~4 ℃冷藏避光保存
8.1.2.13 次氯酸钠溶液(50.0 g/L)
称取50.0g次氯酸钠,溶于1000m水中,完全溶解后备用。
8.1.3 仪器设备
8.1.3.1采样仪器设备
8.1.3.1.1 滤囊过滤的仪器设备
该方法所需器材如下
a)蠕动泵:流量为2L/min。
b)泵管。
c)滤囊(醚砜滤膜,有效过滤面积1300cm,孔径1.0μm)。
d)夹子
e)水表
f)流量控制阀:压力为0.21MPa(对于处理水可任意选择)
g)过滤管。
h)塑料连接
8.1.3.1.2 多孔海绵滤膜模块过滤的仪器设备
该方法所需器材如下
滤芯:压缩后的多孔海绵滤膜模块(600mm压缩到30mm的60层多孔海绵滤膜,其中单层多a)孔海绵滤膜厚10mm,外径55mm,内径18 mm)
b)滤器:带进出水样接口及配套软管和辅助工具
c)蠕动泵
d)泵管。
e)夹子
f)水表。
g)流量控制阀(1L/min~4L/min)g)
8.1.3.2淘洗/浓缩/纯化仪器设备
8.1.3.2.1 滤囊的淘洗/浓缩/纯化设备
该方法所需器材如下。
a)水平振荡器:有臂的水平振荡装置,臂上有垂直安装的过滤夹,最大频率600r/min。
b)250 m锥形离心管。
c)离心机:1 500g 离心力。
d)旋涡搅拌器
e)塑料洗耳球
f)10 ml 吸管。
g)50 ml 吸管
h)100 ml的量筒
i)Leighton 管:一侧平面试管,125 mmX16 mm,带管塞,一侧为 60 mmX10 mm 平面
j)磁粒浓缩器1:适合Leighton管内液体磁分离
k)磁粒浓缩器2:适合微型离心管内液体磁分离。
l)锥形具塞5m微量离心管。
8.1.3.2.2多孔海绵滤膜模块的淘洗/浓缩/纯化设备
该方法所需器材如下。
a)手动或自动多孔海绵滤膜模块淘洗主设备及配套装置(浓缩管及底座,洗涤管及不锈钢虹吸a)管)。
b)真空泵
c)磁力搅拌器和搅拌棒
d)滤膜(孔径3.0um,直径73mm)。
e)磁粒浓缩器1:适合Leighton管内液体磁分离
f)磁粒浓缩器2:适合微型离心管内液体磁分离。
8.1.3.2.3 多孔海绵滤膜模块快速淘洗/浓缩/纯化的设备
a)该方法所需器材如下
b)多孔海绵滤膜模块快速淘洗装置:可压缩空气与淘洗液,自动完成8次及以上反向冲洗程序
c)空气压缩机:压力大于0.5MPa,可压缩15L空气
d)离心机:2 000g离心力
e)锥形离心管:500 mL。
f)蠕动泵
g)磁粒浓缩器1:适合Leighton管内液体磁分离
h)磁粒浓缩器2:适合微型离心管内液体磁分离。
8.1.3.3 染色仪器设备
8.1.3.3.1三通真空泵
8.1.3.3.2湿度孵化盒
8.1.3.3.3载玻片
8.1.3.3.4盖玻片
8.1.3.3.5培养箱
8.1.3.3.6荧光显微镜
8.1.3.3.7、450nm~480nm的蓝色滤光片
8.1.3.3.8、330nm~385nm的紫外光滤光片
8.1.3.3.9测微计。
8.1.3.3.10、移液器:5 μL~20 μL、20 μL~200 μL、200 μL~1 000 L。
8.1.3.3.11巴斯德玻璃吸管。
8.1.3.3.12 小口塑料瓶或玻璃瓶:20L。
所有玻璃器皿和塑料器皿都应在使用后及洗涤前经高压消毒。用热浓洗涤剂溶液清洁器材,然后将它们放到不低于50.0g/L,的次氯酸钠溶液中,至少在室温浸泡30min。用纯水冲洗器材,然后将其放到没有卵囊的环境中干燥。宜尽可能使用一次性物品。
8.1.4 试验步骤
8.1.4.1 采样/淘洗/浓缩
8.1.4.1.1 采样量
因水样中的卵囊数量很少,因此需要浓缩较大体积的水样,采样的体积取决于水样的类型:水源水可采集20L;生活饮用水采集100L。
8.1.4.1.2 滤囊采样和淘洗步骤
8.1.4.1.2.1 采样
按以下步骤采样。
a)连接滤囊以外的采样系统。
b)打开蠕动泵的开关,并将流量调到21/min。
c)在作业线上安装滤囊,用适当的夹子将滤囊的进口和出口分别连接固定
d)记录水表上指示的体积
e)将采样系统连接到自来水龙头或其他水源上
f)通过滤囊过滤适当体积的水样
g)在过滤结束的时候,记录滤囊过滤的水样体积，
h)将连接在水源上的采样系统取下
i)打开泵,尽快把滤囊放空
过滤后,可于0℃~4℃冷藏避光保存滤囊,一般不要超过 72 h。
8.1.4.1.2.2淘洗
选用符合技术参数要求的设备,并参考该设备的说明书进行操作。举例说明如下
a)取下滤囊进水口的乙烯帽,用量筒加110ml,淘洗液A到每个滤囊的外腔中。
b)将滤囊插到有臂的水平振荡器夹子上,滤囊的出水阀在12点钟的位置。
c)打开振荡器的开关,将样本振荡10min。
d)将滤囊中的淘洗液A倾注到250m的锥形离心管中,再将110mL淘洗液A加人滤囊的外腔中。
e)将过滤器插到振荡器的夹钳上,出水阀转到3点钟位置。在80%的功率下,再摇10min。
f)重复操作步骤d),将乙烯帽小心取下,将滤囊中的淘洗液倾注到250mL的锥形离心管中
8.1.4.1.2.3 浓缩
按以下步骤浓缩。
a)将装有淘洗液样本的锥形离心管置于1500g离心15min。自然减速,以免搅起沉淀物
b)用移液器小心地将上清液吸掉,使上清液刚好到沉淀物的上面(不要搅起沉淀物)。
c)如果压实的沉淀物体积小于或等于0.5m1,加纯水到离心管中,使其总体积为10mL。将试管置于旋转式搅拌器上10s~15s,以便使沉淀物再悬浮
d)如果压实的沉淀物体积大于0.5m,用公式(3)确定在离心管中需要的总体积:
总需要体积(mL)=沉淀物体积x10 mL/0.5 mL………………（3）
将再悬浮的沉淀物调整到一个0.5mL相同压实的沉淀物体积,加纯水到离心管中,使其总体积到上面计算的水平。将试管旋转搅拌10s~155,以便使沉淀物再悬浮。记录这个再悬浮物的体积。
8.1.4.1.3多孔海绵滤膜模块采样和淘洗步骤
8.1.4.1.3.1 采样
按以下步骤采样
a)将滤芯(螺栓头朝下)安装在支架上,拧紧盖子(盖子即为进样口)。
b)将滤器连接到需采样的水源进行采样。
注1:为使液体流经滤芯需在顶部施加0.05MPa的压力。推荐的0.05MPa工作压力形成的液体流速为3L/min~41/min。工作压力最大不超过0.8MPa。
注2:采样时如使用导流泵、蠕动泵等泵类装置,安装在滤器上游。
注 3:样品采集可在水源现场或实验室完成。过滤后,于0℃~4℃冷藏避光保存滤芯,一般不要超过 72 h。
8.1.4.1.3.2 淘洗与浓缩
选用符合技术参数要求的设备,并参考该设备的说明书进行操作。举例说明如下。
a)手工淘洗
1)第一次淘洗。将3m滤膜放置到浓缩器中,组装好浓缩管和洗涤管。将滤芯从支架上取下,安装到淘洗器的活塞顶部。将淘洗器的狭口与洗涤管用快接头连接。拉下淘洗器的延伸臂至锁住,从滤芯上去除螺栓。再连接上不锈钢虹吸管。向浓缩管注人600ml淘洗液B,随后连接到快接头上。将活塞上下活动20次,以冲洗解压的滤芯。拆下浓缩管,挤压活塞5次以清除过滤器中的残留液体。
2)第一次淘洗液浓缩。将浓缩管与磁性搅拌棒连接,放置在磁性搅拌盘上,以60r/min~120r/min搅拌。将真空泵连接到浓缩器上,形成压力为13.3 kPa~40.0kPa的真空。打开活栓,使流出液浓缩到30mL~40m。将浓缩液轻轻倒人50ml离心管中。
3)第二次淘洗。浓缩管中重新加入600ml淘洗液B,再连接到洗涤管上。重复第一次淘洗过程，只需10次。
4)第二次淘洗液浓缩。将第一次的浓缩液加入第二次的淘洗液中。按上述方法重复浓缩过程。
5)将3μm滤膜转移到提供的袋子中,加入5mL淘洗液B,隔着袋子用手轻轻摩擦滤膜清洗2次。将清洗液与浓缩液混合
b)自动淘洗
1)第一次淘洗。将3um滤膜放置到浓缩器中,组装好浓缩管和洗涤管。打开自动淘洗器电源。将滤芯从支架上取下,安装到淘洗器的活塞顶部。将淘洗器的口与淘洗管用快接头连接。卸下滤芯上的螺栓。再连接上不锈钢虹吸管。向浓缩管注人600mL淘洗液B,随后连接到快接头上。开始初次浸润,然后进行第一次淘洗。拆下浓缩管,清除过滤器中的残留液体。
2)第一次淘洗液浓缩。将浓缩管与磁性搅拌棒连接,放置在磁性搅拌盘上,以60r/min~120r/min搅拌。将真空泵连接到浓缩器上,形成压力为13.3kPa~40.0kPa的真空。打开活栓,使流出液浓缩到30mL~40m。将浓缩液轻轻倒人50ml离心管中。
3)第二次淘洗。浓缩管中重新加入600mL淘洗液B,再连接到洗涤管上。开始淘洗。拆下浓缩管,清除过滤器中的残留液体。
4）第二次淘洗液浓缩。将第一次的浓缩液加人第二次的淘洗液中。按上述方法重复浓缩过程
5)将3μm滤膜转移到提供的袋子中,加人5mL淘洗液B,隔着袋子用手轻轻摩擦滤膜清洗2次。将清洗液与浓缩液混合。
8.1.4.1.4 多孔海绵滤膜模块采样及快速淘洗步骤
8.1.4.1.4.1 采样
采样方法如下:
a)将滤芯(螺栓头朝下)安装在支架上,拧紧盖子(盖子即为进样口);
b)将滤器连接到需采样的水源进行采样。
注1:为使液体流经滤芯需在顶部施加0.05MPa的压力。推荐的0.05MPa工作压力形成的液体流速为3L/min~4L/min。工作压力最大不超过0.8 MPa。
注2:采样时如使用导流泵、蠕动泵等泵类装置,安装在滤器上游。
注3:样品采集可在水源现场或实验室完成。过滤后,于0℃~4℃冷藏避光保存滤囊,一般不要超过 72 h。
注4:本方法亦适用于浊度高的水源水的采样。
8.1.4.1.4.2 淘洗
采用符合技术参数要求的多孔海绵滤膜模块快速压力淘洗装置可使淘洗过程全自动完成,将压力淘洗装置准备就绪,向淘洗液瓶中加入足量的淘洗液C,利用连接锁将淘洗液瓶与压力淘洗装置连接，确保二者之间形成良好密封。连接压缩空气源和压力淘洗装置,保证足够的空气压力和体积。
举例说明如下。
a)打开压力淘洗设备的舱门。
b)滤器进样口朝上,移开样品阻留器,连接分流调节器(滤芯仍在滤器内)
c)将滤器倒转,用快接头连接到压力淘洗器上。
d)将500m锥形离心瓶放置在样品收集器支架上,关闭压力淘洗装置
e)开始自动淘洗。
g)淘洗结束时,打开压力淘洗装置。卸下滤器,再取下分流调节器,打开滤器,弃掉滤芯f)将离心瓶盖好，从样品收集器支架中取出。
8.1.4.1.4.3 浓缩
按以下步骤浓缩
a)将装有淘洗液样本的离心瓶置于2000g离15min。慢慢减速,以免搅起沉淀物。记录沉淀物体积。
注:勿用制动器!
b)离心后,用吸气装置将沉淀物上层悬浮液体吸出,保留8m~10mL,液体(吸气装置的压力应小于 3.3 kPa)
c)如果压实的沉淀物体积小于或等于0.5ml,将试管置于旋转式搅拌器20s,然后将样品转入Leighton 管中;用1ml纯水冲洗离心瓶二次,清洗液转人同- Leighton 管中。
d)如果压实的沉淀物体积大于 0.5mL,用公式(4)确定在离心管中需要的总体积,以便将再悬浮的沉淀物调整到相当于0.5m压实沉淀物的体积。
需要的总体积(mL)=沉淀物体积X10mL/0.5ml……………………(4)
加纯水到离心管中,使其总体积到上面计算的水平。将试管旋转搅拌10s~15s,以便使沉淀物再悬浮。记录这个再悬浮物的体积。
8.1.4.2免疫磁分离
8.1.4.2.1 长时间在0℃~4℃冷藏保存后,可能会在缓冲液A中形成一些结品沉淀。为了确保这些沉淀的结晶能够再溶解,使用前应将其置室温(15℃~22℃)中直至结晶溶解。
8.1.4.2.2 加1m缓冲液A和1ml缓冲液B到Leighton 管中。
8.1.4.2.3定量转移10m水样浓缩物到eighton管中。
8.1.4.2.4 将抗隐孢子虫抗体和抗贾第鞭毛虫抗体的磁微粒原液置于漩涡混合器上搅拌,以便使珠粒悬浮。通过倒置试管的方法保证珠粒再悬浮,并确定底部没有残留的小团。
8.1.4.2.5向含有水样浓缩物和缓冲液样品的Leighton管中各加100L上述悬浮的微粒。
8.1.4.2.6将含有样品的Leighton管固定到旋转式的搅拌器上,25r/min旋转1h。
8.1.4.2.7将试管从搅拌器上取下,然后再将其放在磁粒浓缩器1上,并将试管有平面的一边朝向磁铁。
8.1.4.2.8用手柔和地以大约90角头尾相连地摇动试管,使试管的盖顶和基底轮流上下倾斜。以每秒大约倾斜一次的频率持续2min。
8.1.4.2.9 如果磁粒浓缩器1中的样品静置10s以上,就要在进行下一个步骤之前,重复步骤8.1.4.2.8
8.1.4.2.10立即打开顶端的盖,同时将固定在磁粒浓缩器1上的试管中的所有上清液倒到废液器中做这一步骤时,不要摇动试管,也不要将试管从磁粒浓缩器1上取下。
8.1.4.2.11 将试管从磁粒浓缩器1上取下,加1ml,缓冲液A。非常柔和地将试管中的所有物质再悬浮。不要形成漩涡。
8.1.4.2.12 将试管中的所有液体定量转移到有标签的1.5m微量离心管中。8.1.4.2.133将微量离心管放到未加磁条的磁粒子浓缩器2中,然后加人磁条。
8.1.4.2.14 用手180角轻轻地摇动试管。每秒大约摇动一个180角,持续大约1min。在这一步结束时,珠粒和卵会在试管的背面形成一个褐色圆点。
8.1.4.2.15 立即将固定在磁粒浓缩器2上的离心管和顶盖中的上清液吸出。如果同时处理一个以上的样品,就要在吸去每个离心管的上清液之前,进行3个180角的摇动动作,不要扰乱磁铁邻近管壁上的附着物。不要摇动离心管。不要将离心管从磁粒浓缩器2上取下。
8.1.4.2.16将磁条从磁粒浓缩器2上取下。
8.1.4.2.17加 50 u0.1 mol/l的盐酸至上述微量离心管中,涡旋混合 10s。
8.1.4.2.18将试管放在磁粒浓缩器2上,室温垂直静置10min。
8.1.4.2.19用力涡旋5 s~10 s。
8.1.4.2.20保证所有样品都在试管的底部,然后将微量离心管放在磁粒浓缩器2上
8.1.4.2.21 再将磁条放到磁粒浓缩器2上,以大约90角头尾相连地轻轻摇动试管。使试管的盖顶和基底轮流上下倾斜,以每秒大约倾斜一次的频率持续30s。
8.1.4.2.22 准备一个载玻片,加5uL1mol/l的氢氧化钠溶液至样品井中。
8.1.4.2.23不要将微量离心管从磁粒浓缩器2上取下。将所有样品从磁粒浓缩器2上的微量离心管中转移到有氢氧化钠的样品井中。不要扰乱试管背壁上的珠粒。
8.1.4.3染色
8.1.4.3.1将有样品的载玻片置37℃培养箱中干燥不超过2h,或置室温避光自然风干
8.1.4.3.2在该玻片上加一滴(50 μL)的纯甲醇,然后让它自然干燥3min~5 min。
8.1.4.3.3 用试管准备所需体积(50L)的抗隐孢子虫单克隆抗体和抗贾第鞭毛虫单克隆抗体FITC工作稀释液(1/1:Cellabs/PBS)
8.14.3.4 加50u,上述FITC单克降抗体工作稀释液至玻片上。将载玻片放到湿盒中于36 ℃±1℃培养30 min 左右。
8.1.4.3.5 30min后,取出载玻片,然后用一个干净的顶端带有真空源的巴斯德玻璃吸管轻轻地吸掉过量的荧光素标记单克隆抗体。
8.1.4.3.6在每个玻片上加70L的PBS,静置1min~2min后,吸掉多余的PBS
8.1.4.3.7 加50 μLDAPI溶液(使用时配制,即加10xl,2mg/ml,溶于纯甲醇中的DAPI于50ml,的PBS中)到玻片上，然后让它在室温静置2min左右
8.1.4.3.8 吸掉过量的DAPI溶液。
8.1.4.3.9加70uL的PBS到玻片上,静置1min~2min后,吸掉多余的PBS。
8.1.4.3.10 加70uL的纯水到玻片上,静置1min后,吸掉多余的纯水。
8.1.4.3.11 让载玻片在暗处干燥后,加一滴封固剂,盖上盖玻片,然后将它存放在干燥的暗盒中,备查注:如使用商用染色试剂盒,可按照试剂盒内说明书要求进行染色，
8.1.4.4镜检
打开显微镜。预热15min后,在 200倍的荧光显微镜下检查,再依次在400倍的蓝光激发(FITC模式)、400倍的紫外激发(DAPI模式)下进一步证实。若DAPI染色结果不能确认时,可以使用DIC模式观察孢囊内部结构进行确认。
贾第鞭毛虫的孢囊呈椭圆形,长为8μm~14 μm,宽为?um~10 μm。在 FITC模式下,孢囊壁会发出苹果绿色的荧光。在DAPI模式下,当内部呈现亮蓝色或者观察到1个~4个细胞核时,呈DAPI阳性,可确认为贾第鞭毛虫孢囊;若呈现边缘绿色,内部浅蓝色时,呈DAPI阴性,建议采用DIC模式进一步观察,若能看到孢囊的细胞核、中轴等内部结构,可确认为贾第鞭毛虫孢囊。
隐孢子虫的卵囊呈稍微椭圆的圆形,直径为4μm~8μm。在FITC模式下,卵囊壁有苹果绿色荧光。在DAPI模式下,当内部呈现亮蓝色或者观察到1个~4个细胞核时,呈DAPI阳性,可确认为隐孢子虫卵囊;若呈现边缘绿色,内部浅蓝色时,呈DAPI阴性,建议采用DIC模式进一步观察,若能看到卵囊内有1个~4个月牙形子孢子,可确认为隐孢子虫卵囊。
计数整个玻片染色区域,呈现表7特征的可判断为孢(卵)
8.1.5 试验数据处理
8.1.5.1 按公式(5)计算每10升样本中的孢(卵)囊数:
8.1.5.2按公式(6)计算分析的检测限:
8.1.6 质量控制
8.1.6.1 免疫荧光质量控制
免疫荧光试剂盒的质量控制应每批次试验做一次,由阳性对照和阴性对照组成
8.1.6.1.1 阴性对照
按以下步骤进行
a)准备一个载玻片
b)加50纯水,然后将它放在培养箱中干燥
c)染色步骤应符合8.1.4.3的要求。
d)对整个染色区域进行计数,不应找出任何贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫的卵囊
8.1.6.1.2 阳性对照
按以下步骤进行
a)准备一个载玻片。
b)将阳性对照样品涡旋2min,以混匀储存的原虫孢(卵)囊。”
c)在玻片上滴加5μL贾第鞭毛虫孢囊和5L,隐孢子虫卵囊阳性样本,然后放在培养箱中干燥
d)染色步骤应符合8.1.4.3的要求。
e)对整个染色区域进行计数,应找到表7中描述的规则而均匀的染色孢和卵囊e)
8.1.6.2 试验全程的质量控制
整个步骤(从采样到显微镜检查)的质量控制应每三个月做一次。它由两个试验组成:20L加有原虫的水作为阳性对照,20L的纯水作为阴性对照。
8.1.6.2.1 阴性对照
按以下步骤进行
a)加20L纯水到小口塑料瓶中
b)按样品分析步骤分析阴性对照水样。不应找到任何贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊
8.1.6.2.2阳性对照
8.1.6.2.2.1 原虫接种液的计数
按以下步骤进行。
a)涡旋2min储存的原虫孢(卵)囊
b)在一个有10mL,纯水的烧杯中加一些孢囊和卵囊,以便得到一个最终浓度大约每毫升5X104个孢(卵)囊的溶液。
c)用磁棒搅拌30 min。
d)用载玻片测定这种溶液的浓度10次
e)用载玻片[加大约250个孢(卵)到玻片上]测定这种溶液的浓度5次。
计数这两种方法的浓度和标准差。如果标准差小于25%,那么就可以把这个读数看作是正确的如果标准差大于25%,就要制备新的原虫接种液,然后再测定它的浓度。
8.1.6.2.2.2 阳性对照的分析
按以下步骤进行
a)在装有10工纯水的小口塑料或玻璃瓶中加500个贾第鞭毛虫的孢囊和500个隐孢子虫的卵囊。
b)过滤该水样。
c)用10工纯水冲洗小口塑料瓶,然后继续过滤
d)按样品分析步骤分析阳性对照水样。
如回收率在10%~100%之间,则符合质量控制要求;如不在此范围,需检查所有的设备和试剂,同时再做一个阳性对照。
参考文献
《GB/T 5750.12-2023 生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》
相关资源
名称:大肠杆菌|Escherichia coli
菌株编号:HZB364670
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更新日期：2024-10-16
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编制人：木木