GB/T 5750.12-2023生活饮用水标准检验方法第12部分:微生物指标-总大肠菌群

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　浏览量：577　　发布时间：2024-09-25 17:00:26

引言

微生物污染是评价水质安全性的关键指标之一，对人类健康构成直接威胁。在众多微生物指标中，大肠杆菌因其普遍存在于人和温血动物的肠道中，且能够指示粪便污染的存在，成为了监测生活饮用水质量的重要生物标志物。平皿计数法作为一种经典的微生物检测技术，被广泛应用于评估水体中的细菌负荷。本方法依据《GB/T 5750.12-2023 生活饮用水标准检验方法第12部分:微生物指标》，详细介绍大肠菌群。

5.1多管发酵法

5.1.1原理

经36℃±1℃培养24h,发酵乳糖产酸产气、经证实试验和革兰氏染色检测水中总大肠菌群的方法。

5.1.2 培养基与试剂

5.1.2.1 乳糖蛋白胨培养液

5.1.2.1.1 成分

5.1.2.1.2 制法

将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于纯水中,调整pH为7.2~7.4,再加入1mL16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液,充分混匀,分装于装有小倒管的试管中,经115℃高压蒸汽灭菌20min后,于0℃~4℃冷藏避光保存。

5.1.2.2二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液

除纯水为500m,其他成分应符合5.1.2.1的要求.

5.1.2.3伊红美蓝培养基

5.1.2.3.1 成分

5.1.2.3.2 制法

将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于纯水中,校正pH为7.2,加人乳糖,混匀后分装,经115 ℃高压蒸汽灭菌 20min。临用时加热融化琼脂,冷至50℃~55 ℃,加入伊红和美蓝水溶液,混匀,倾注平皿。

5.1.2.4 革兰氏染色液

5.1.2.4.1 结晶紫染色液

5.1.2.4.1.1 成分

5.1.2.4.1.2 制法

将结晶紫溶于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。

注:结晶紫不可用龙胆紫代替,前者是纯品,后者不是单一成分,易出现假阳性。结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。

5.1.2.4.2 革兰氏碘液

5.1.2.4.2.1 成分

5.1.2.4.2.2 制法

将碘片和碘化钾混合,再加入纯水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加纯水。

5.1.2.4.3 脱色剂

乙醇[φ(C2H5OH)=95%]。

5.1.2.4.4 沙黄复染液

5.1.2.4.4.1 成分

5.1.2.4.4.2 制法

将沙黄加人乙醇中,待完全溶解后加人纯水

5.1.2.4.5 染色法

5.1.2.4.5.1 将培养18h~24h的培养物涂片。

5.1.2.4.5.2将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗

5.1.2.4.5.3滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。

5.1.2.4.5.4滴加脱色剂,摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s,水洗。

5.1.2.4.5.5 加沙黄复染液,复染1min,水洗,待干,镜检。

5.1.3 仪器设备

5.1.3.1培养箱:36 ℃±1℃。

5.1.3.2冰箱。

5.1.3.3电子天平

5.1.3.4显微镜。

5.1.3.5平皿:直径 9cm。

5.1.3.6试管。

5.1.3.7无菌吸管:1 mL、10 mL。

5.1.3.8锥形瓶

5.1 3.9小倒管。

5.1.3.10载玻片

5.1.4 试验步骤

5.1.4.1乳糖发酵试验

5.1.4.1.1 用无菌吸管或移液器吸取10ml水样接种到10ml,双料乳糖蛋白胨培养液中,取1ml 水样接种到10ml,单料乳糖蛋白胨培养液中,另取1ml,水样注入到9ml无菌生理盐水中,混匀后取1ml(即 0.1 ml,水样)注入到10ml,单料乳糖蛋白胨培养液中,每一稀释度接种5管;对已处理过的出厂自来水,需经常检验或每天检验一次的,可直接接种5份10mL,水样双料培养基,每份接种10 mI水样。

5.1.4.1.2 检验水源水时,如污染较严重,应加大稀释度,可接种1ml、0.1mL、0.01ml,甚至 0.1 ml0.01mL、0.001m1,每个稀释度接种5管单料乳糖蛋白胨培养液,每个水样共接种15管。接种1ml以下水样时,应作10倍递增稀释后,取1ml,接种,每递增稀释一次,换用1支1ml, 无菌吸管。5.1.4.1.3将接种管置于36℃士1℃培养箱内,培养24h±2h,如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸,则可报告为总大肠菌群未检出,如有产酸产气者,则按下列步骤进行。

5.1.4.2 分离培养

将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,于36℃士1℃培养箱内培养18h~24h,观察菌落形态,挑取符合下列特征的菌落进行革兰氏染色镜检:

深紫黑色、具有金属光泽的菌落;

紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落;

淡紫红色、中心较深的菌落。

5.1.4.3证实试验

经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌,同时接种乳糖蛋白胨培养液,置36℃士1℃培养箱中培养24h士2h,有产酸产气者,即证实有总大肠菌群存在。

5.1.5试验数据处理

根据证实为总大肠菌群阳性的管数,查MPN表(见表3和表4),报告每100ml,水样中的总大肠菌群MPN值。稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均为阴性时,可报告总大肠菌群未检出。