GB/T 5750.12-2023生活饮用水标准检验方法第12部分:微生物指标-肠球菌
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：296 发布时间：2024-09-25 17:00:57
引言
微生物污染是评价水质安全性的关键指标之一，对人类健康构成直接威胁。在众多微生物指标中，大肠杆菌因其普遍存在于人和温血动物的肠道中，且能够指示粪便污染的存在，成为了监测生活饮用水质量的重要生物标志物。平皿计数法作为一种经典的微生物检测技术，被广泛应用于评估水体中的细菌负荷。本方法依据《GB/T 5750.12-2023 生活饮用水标准检验方法 第12部分:微生物指标》，详细介绍了肠球菌。
10.1.1 原理
多管发酵法计数基于泊松分布的MPN理论,用于估算出样品单位体积中细菌数的MPN值。本试验中选择使用肠球菌肉汤,因其中含有叠氮化钠,有利于肠球菌生长的同时抑制革兰氏阴性菌的繁殖。
10.1.2.1 肠球菌肉汤培养基
警示:10.1.2.1和10.1.2.2中叠氨化钠属于剧毒化学品,储存及配制过程中需小心谨慎操作,避免高热及剧烈震动引起意外。
10.1.2.1.1 成分
10.1.2.1.2 制法
将上述各成分加热煮沸至溶解,待冷却后,调节pH至7.0~7.4。每管分装10mlL,121℃高压蒸汽灭菌15min。若制备双料浓度的肠球菌肉汤,可将上述配方中纯水改为500m
10.1.2.2肠球菌琼脂(胆汁七叶苷叠氮钠琼脂)培养基
10.1.2.2.1 成分
10.1.2.2.2 制法
将上述各成分加热煮沸至溶解,待冷却后,调节pH至7.0~7.4,121℃高压蒸汽灭菌15min,于45℃~50 ℃倾注平板备用。
10.1.2.3 胆汁七叶苷琼脂培养基(BEA)
10.1.2.3.1 成分
10.1.2.3.2 制法
将上述各成分加人纯水中,缓慢加热溶解,121℃高压蒸汽灭菌15min,于45℃~50℃倾注平板备用。
10.1.2.4 脑心浸液肉汤(BHIB)培养基
10.1.2.4.1 成分
10.1.2.4.2 制法
将各成分加人纯水中,加热溶解,冷却后调节pH至7.0~7.4,分装到试管中,121℃高压蒸汽灭菌15 min。
10.1.2.5 含6.5%氯化钠脑心浸液肉汤培养基
10.1.2.5.1 成分
10.1.2.5.2 制法
将各成分加入纯水中,加热溶解,冷却后调节pH至7.0~7.4,分装到试管中,121℃高压蒸汽灭菌15 min。
10.1.2.6 脑心浸萃琼脂(BHIA)培养基
10.1.2.6.1 成分
10.1.2.6.2 制法
将各成分加入纯水中,加热溶解,冷却后调节pH至7.0--7.4,121℃高压蒸汽灭菌15min,于45℃--50℃倾注平板备用。
10.1.2.7 革兰氏染色液
应符合5.1.2.4的要求。
10.1.3仪器设备
10.1.3.1高压蒸汽灭菌器。
10.1.3.2电炉。
10.1.3.3恒温培养箱:35℃±2℃、35 ℃±0.5℃、45 ℃±0.5 ℃。
10.1.3.4冰箱。
10.1.3.5电子天平。
10.1.3.6显微镜。
10.1.3.7PH 计。
10.1.3.8平皿:直径 9cm。
10,1.3.9 试管:18 mmX180 mm、15 mmX160 mm。
10.1.3.10 无菌吸管:1mL、10 mL。
10.1.3.11 锥形瓶:500mL。
10.1.3.12 酒精灯。
10.1.3.13接种环
10.1.3.14 载玻片。
10.1.4 试验步骤
10.1.4.1 增菌液发酵试验
10.1.4.1.1 以无菌操作方法用无菌吸管吸取10mL充分混匀的水样接种到10ml双料肠球菌肉汤培养液中,取1mL水样接种到10mL单料肠球菌肉汤培养液中。另取1mL水样注入到9ml无菌生理盐水中,充分混匀后取1mL(即0.1ml水样)注人到10mL单料肠球菌肉汤培养液中。每一稀释度平行接种3管。
10.1.4.1.2 当生活饮用水可能处于较为严重的污染时,应加大稀释度,可接种1ml,,0.1 ml,0.01ml或0.1mL、0.01ml、0.001ml,每个稀释度接种3管,每个水样共接种9管。宜选择包含阴性反应终点,即含有非3管全部发酵最低稀释度的3个连续稀释度。接种1mL以下水样时,应作10倍递增稀释后,取1ml水样接种到9ml无菌生理盐水中,充分混后取1mL再进行稀释。每次更换1支1 mL无菌吸管
10.1.4.1.3将肠球菌肉汤管置于35℃士2℃培养箱内,培养24h士2h。若肠球菌肉汤无明显黑色沉淀,则可报告肠球菌未检出。如肠球菌肉汤呈现明显黑色沉淀,则按下列步骤进行。
10.1.4.2 分离培养
将带黑色沉淀的肠球菌肉汤增菌液分别接种于肠球菌琼脂平板,于35℃士2℃培养24h+2h。观察菌落形态,挑取有棕色菌环的棕黑色大菌落10个,进行革兰氏染色、镜检和证实试验。
10.1.4.3 证实试验
挑取10个典型菌落,同时接种BHIB肉汤和BHIA平板,BHIB肉汤置35℃士0.5℃培养24h士2h,BHIA平板置35℃士0.5℃培养48h+2h。纯培养后BHIB肉汤分别接种BEA平板,6.5%氯化钠BHIB肉汤和BHIB肉汤。将BEA平板和6.5%氯化钠BHIB肉汤置于35℃士0.5℃培养48h士2h:BHIB肉汤置于45℃士0.5℃培养48b+2h,观察细菌生长情况。挑取 BHIA平板上生长菌落进行革兰氏染色。染色镜检为革兰氏染色阳性球菌;BEA平板上生长并水解七叶苷(形成黑色或棕色沉淀);6.5%氯化钠的BIIB肉汤35℃士0.5 ℃生长良好;BIIIB肉汤45℃士0.5 ℃生长;具备以上特征的典型菌落可证实为肠球菌。
10.1.5 试验数据处理
根据证实为肠球菌阳性的管数,对照表8,报告每100ml水样中的肠球菌MPN值,以MPN/100m表示。如所有培养管均为阴性时,可报告肠球菌未检出。
10.1.6 质量控制
10.1.6.1 培养基检验
更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验,培养基质量控制参照GB4789.28进行。阳性菌株为粪肠球菌(Enterococcusfecalis)标准菌株ATCC29212(CICC23658或其他等效标准菌株),阴性菌株为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)标准菌株ATCC25922(CICC10305或其他等效标准菌株)。其中,肠球菌肉汤阳性菌株接种浓度为10CFU/ml~100CFU/ml,阴性菌株接种浓度为1000CFU/ml,~5 000CFU/ml,接种量均为1m,若使用的是定量标准菌株,则可按照给定值直接稀释后,按照试验步骤10.1.4.1进行操作。阳性菌株经肠球菌肉汤培养液培养后应产生黑色沉淀:阴性菌株不应产生黑色沉淀。肠球菌琼脂平板分别采用阳性和阴性菌株进行验收,其他培养基按照10.1.4.3用阳性菌株进行验收。
10.1.6.2 对照试验
定期进行阳性及阴性对照试验。将阳性菌株粪肠球菌和阴性菌株大肠埃希氏菌制成浓度为100CFU/100ml.~1000CFU/100ml,的菌悬液,若使用的是定量标准菌株,则可按照给定值直接稀释后使用,按10.1.4的要求进行操作。阴性对照试验的肠球菌肉汤培养基中不应产生黑色沉淀;阳性对照试验的肠球菌肉汤培养基中应产生黑色沉淀,再经过10.1.4.2和10.1.4.3确认检出肠球菌。如阴性对照或阳性对照试验结果不符合,本批次试验结果无效,应查明原因后重新测定。
参考文献
《GB/T 5750.12-2023 生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》
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更新日期：2024-09-23
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编制人：木木