微生物检测技术：平皿计数法在生活饮用水中定量分析的应用
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：350 发布时间：2024-07-25 13:38:49
引言
微生物污染是评价水质安全性的关键指标之一，对人类健康构成直接威胁。在众多微生物指标中，大肠杆菌因其普遍存在于人和温血动物的肠道中，且能够指示粪便污染的存在，成为了监测生活饮用水质量的重要生物标志物。平皿计数法作为一种经典的微生物检测技术，被广泛应用于评估水体中的细菌负荷。本方法依据《GB/T 5750.12-2023 生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》，详细介绍了如何通过平皿计数法测定生活饮用水中大肠杆菌的浓度。
图1、《GB/T 5750.12-2023 生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》
平皿计数法原理
平皿计数法是一种用于测定样品中微生物菌落总数的方法。通过将一定体积的样品与融化的琼脂培养基混合后倒入平皿中，在适宜的温度下培养，使样品中的微生物生长形成可见的菌落，从而计数。以含有大肠杆菌的水样为例，1ml水样在营养琼脂培养基上、在有氧条件下36℃±1℃培养48h后，所得1ml水样中的菌落总数的方法。
培养基成分与制备
营养琼脂成分：
蛋白胨：10.0 g
牛肉膏：3.0 g
氯化钠：5.0 g
琼脂：10.0-20.0 g
纯水：1000 mL
制备方法：
将上述成分混合后加热溶解，调整pH至7.4-7.6，分装后121°C高压蒸汽灭菌20分钟，冷藏保存于0°C-4°C。
所需仪器设备
1、高压蒸汽灭菌器
2、培养箱（36°C±1°C）
3、电炉
4、电子天平
5、冰箱
6、放大镜或菌落计数器
7、pH计或精密pH试纸
8、无菌试管、平皿（直径9 cm）、吸管或移液器、采样瓶等
实验步骤
含有大肠杆菌的生活饮用水
1、以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取1 mL充分混匀的水样，注入无菌平皿中。
2、倾注约15 mL已融化并冷却至45°C左右的营养琼脂培养基，并立即摇动平皿，使水样与培养基充分混匀。
3、每次检验时应做一个平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
4、待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1°C培养箱内培养48小时±2小时。
5、进行菌落计数，即为1 mL水样中的菌落总数。
水源水
1、以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取1 mL充分混匀的水样，注入盛有9 mL无菌生理盐水的试管中，混匀成1:10稀释液。
2、用无菌吸管或移液器吸取1:10的稀释液1 mL，注入盛有9 mL无菌生理盐水的试管中，混匀成1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000、1:10000等稀释度的液体备用。
3、每稀释一个稀释度，应更换一次1 mL无菌吸管或吸头。
4、用无菌吸管或移液器吸取2到3个适宜稀释度的水样1 mL，分别注入无菌平皿内。
5、之后的操作同生活饮用水的检验步骤。
结果报告
在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时使用。
在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘以2以代表全皿菌落数。
不同稀释度的选择及报告方法
1、选择平均菌落数在30-300之间者进行计算。
2、若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围，则将该菌落数乘以稀释倍数报告结果（见表1中实例1）。
3、若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视两者之比值来决定：
若其比值小于2，应报告两者的平均数(如表1中实例2)。
若大于或等于2，则报告其中稀释度较小的菌落总数(如表1中实例3和实例4)。
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告结果(见表1中实例5)。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告结果(见表1中实例6)。
6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告结果(见表1中实例7)。
7、若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告结果。
8、如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意计数其中2个平板1 cm²中的菌落数，除以2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6 cm²，再乘以稀释倍数报告结果。
9、菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面零的个数也可用10的指数来表示。
表1、稀释度选择及菌落总数报告方式
| 实例 | 不同稀释度的平均菌落数 | 两个稀释度菌落数之比 | 菌落总数/（CFU/mL） | 报告方式/（CFU/mL） | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 10^-1 | 10^-2 | 10^-3 | ||||
| 1 | 1365 | 164 | 20 | - | 16400 | 16000或1.6×10^4 |
| 2 | 2760 | 295 | 46 | 1.6 | 37750 | 38000或3.8×10^4 |
| 3 | 2890 | 271 | 60 | 2.2 | 27100 | 27000或2.7×10^4 |
| 4 | 150 | 30 | 8 | 2 | 1500 | 1500或1.5×10^3 |
| 5 | 多不可计 | 1650 | 513 | - | 513000 | 510000或5.1×10^5 |
| 6 | 27 | 11 | 5 | - | 270 | 270或2.7×10^2 |
| 7 | 多不可计 | 305 | 12 | - | 30500 | 31000或3.1×10^4 |
总结
本文详细介绍了利用平皿计数法测定生活饮用水中大肠杆菌浓度的具体步骤和注意事项。通过对水样的适当稀释和平皿培养，结合营养琼脂培养基的支持，可以实现对水中大肠杆菌的准确计数。
参考文献
《GB/T 5750.12-2023 生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》
【相关资源】
菌株编号：HZB218192
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更新日期：2024-07-25
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