实验指南 | 饮用水中铜绿假单胞菌的检验方法

一、实验目的

1、熟悉铜绿假单胞菌的生物学特性。

2、掌握饮用水中铜绿假单胞菌检验的方法

二、基本原理

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）原称绿脓杆菌，属于假单胞菌（Pseudomonas）广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，也是水源和食品中常见的条件致病菌。铜绿假单胞菌是革兰氏阴性杆菌，菌体大小（0.5~1）μm×（1.5~5.0）μm，细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，无芽胞，无荚膜。铜绿假单胞菌生长对营养要求不高，专性需氧，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃。在普通平板上生长良好，专性需氧，菌落形态不一，多为直径2~3mm，边缘不整齐，扁平湿润。在血平板上会形成透明溶血环，液体培养呈混浊生长，并有菌膜形成。铜绿假单胞菌能产生两种水溶性色素：一种是绿脓素，为蓝绿色的吩嗪类化合物，无荧光性，具有抗菌作用；另一种为荧光素，呈绿色。绿脓素只有铜绿假单胞菌产生，故有诊断意义。

我国国家标准《食品安全国家标准包装饮用水》（GB19298-2014）和《食品安全国家标准饮用天然矿泉水》（GB8537-2018）对铜绿假单胞菌等微生物限量有明确的要求，见表1。并规定按照国家标准《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》（GB8538-2016）中开展检验。本方法采用滤膜法，将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将过滤膜移至假单胞菌琼脂基础培养芽（CN）琼脂选择性培养基上，于（36±1）℃培养24~48h，典型菌落能够在CN琼脂培养基上生长并产生绿脓素，能够利用乙酰胺产胺的革兰氏阴性无芽孢杆菌，证实为铜绿假单胞菌。

表1、包装饮用水和饮用天然矿泉水的微生物限量

三、检验设备和试剂

（一）主要设备

百级洁净工作台、抽滤过滤系统、玻璃棒、滤纸等。

（二）培养基和试剂

假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂，金氏B（King's B）培养基，乙酰胺液体培养基，绿脓菌素测定用培养基。

四、检验程序

饮用水中铜绿假单胞菌检验程序如图1所示。

图1、饮用水中铜绿假单胞菌检验程序

五、检验步骤

（一）水样过滤

在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。

（二）培养

将平板倒置于（36±1）℃培养24~48h，并防止干燥。

（三）结果观察

1、在培养20~24h和40~48h后观察滤膜上菌落的生长情况并计数。

2、计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）疑似铜绿假单胞菌的菌落，并进行绿脓菌素确证性试验。

3、在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确证性试验。

4、将其他所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶测试、乙酰胺液体培养基、金氏B培养基确证性试验，培养20~24h观察结果，防止因为培养40~48h导致菌落过分生长而出现菌落融合。在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤见表2。

表2、在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤

（四）确证性试验

1、营养琼脂

尽可能将所有经滤膜过滤后，在（36±1）℃培养了20~24h，将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基，于（36±1）℃培养了20~24h。检查再次纯化的菌落，并将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验。

2、氧化酶试验

取2~3滴新鲜配置的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上，用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上，在10s内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。

3、金氏 B（King'sB）培养基

红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上，于（36±1）℃恒温箱培养1~5d。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。

4、乙酰胺肉汤

将第一步中的纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在（36±1）℃培养20~24h。然后向每支试管培养物加入1~2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。确证性试验结果判定见表2。

图2、铜绿假单胞菌生长在金氏培养基上的紫外灯观察

（五）计数

将产生绿脓色（蓝色/绿色）或氧化酶反应呈阳性，在紫外灯下产生荧光，且在乙酰胺肉汤中产氨的所有菌落证实为铜绿假单胞菌，并进行计数。

通过计数培养后的滤膜上的菌落以获得铜绿假单胞菌的数量。其他产生荧光或者呈红棕色的菌落需要进一步验证。（最初滤膜上显荧光的菌落经氧化酶反应均呈阳性，因此不需在这个测试中计数。）

（六）结果与报告

根据蓝色或绿色菌落的计数和确证性试验的结果，计算每250mL水样中的铜绿假单胞菌数量。菌落计数按如下公式计算：

N=P+F（c1/n1）+R（c2/n2）

式中：

P-呈蓝/绿色的菌落数；

F-显荧光的菌落数；

c1-产氨阳性的显荧光菌落数；

n1-进行产胺测试的显荧光菌落数：

R-呈红褐色的菌落数；

c2-产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均阳性的红褐色菌落数；

n2-进行产胺、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。

结果以CFU/250ml计。

【相关资源】

名称：铜绿假单胞菌/Pseudomonas aeruginosa

菌株编号：HZB224149

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更新日期：2024-05-28

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编制人：冬冬