质粒载体
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：217 发布时间：2024-06-25 13:23:16
选择标记
质粒载体含有遗传标记，它赋予带有质粒的细菌在选择条件下以较强的生长优势。在分子克隆中，这些标记用来:
选择带有质粒的细菌克隆在实验室中，质粒 DNA 通过人工转化过程导入细菌中。即使在最佳条件下，转化通常是低效的，并且质粒仅在少数的细菌中稳定存在。由质粒携带的选择标记可以使这些稀少的转化体容易被选择。这些质粒编码的标记具有特殊的抗生素抗性(即抗生素存在的情况下的生长能力)，如卡那霉素、氨苄青霉素和羧苄青霉素、四环素。这些抗生素的性能和模式将在本章术的信息栏中讨论。
防止负载质粒 DNA或质粒编码蛋白质所致的危险因素，保护转化的细菌星现低拷贝数(<20拷贝数/细胞)的质粒不会过度妨碍宿主细胞。然而，大量证据表明:高拷贝数的质粒和大量的重组蛋白可严重妨碍转化细胞的生长甚至生存(Murray and Kelley 1979;Beck and Bremer 1980)。为了防止质粒被从细菌中清除，在培养基中一直加入合适的抗生素来维持选择压力是重要的。
1973-1978
在70年代早期，典型的选择标记kanr、ampr和tetr被引入含pMB1(或coE1)复制子的质粒中(请参考信息栏中“卡那霉素”、“四环素”、“氨苄青霉素”、“羧苄青霉素”)。最先被用做克隆载体的质粒pSC101(Cohenetal.1973)、coE1(Hershfield etal.1974)和pCR1(Coveyetal.1976)在用途的多样性方面有所局限:要么复制效率低，要么携带的选择标记不合适，并且没有一个质粒含有两个以上可供进行克隆的限制酶切位点。第一个将所有可用的性质集于一身的最理想的质粒是pBR313(Bolivaret al.1977a，b;请参见信息栏“pBR322”)。它可以进行松弛型复制，带有两个选择标记(tetr和ampr)和一些有用的限制酶切位点。然而，pBR313太大，作为载体而言，它自身的 DNA有一半以上在功能上都是非必需的。随着pBR322质粒的构建，标志着质粒载体发展的第一阶段的结束(Bolivaretal.1977b)。pBR322 质粒长4.36 kb，去掉了大部分非必需序列。很快它便成为应用最为广泛的克隆载体。现在使用的许多质粒载体都是它的直系后裔(综述见Balbas etal.1986)。
1978~1983
此阶段某些质粒得到改进，如pBR322的质粒载体发展为长度越来越小、拷贝数越来越高，并且能够接受多种限制酶切割后产生的外源DNA片段。能够克隆到质粒里的DNA片段大小没有严格的上限。然而,质粒载体的大小缩减至最小有许多优点,随着质粒 DNA 大小的缩减，质粒的拷贝数、稳定性和转化效率都有所增加。在保证转化效率不显著降低的条件下，质粒越小，可容纳的外源DNA的区段就越长。此外，因为coIE1质粒复制子越小，复制的拷贝数越高，所以，当含有外源DNA序列的转化克隆通过放射性探针筛选时，外源 DNA的产量有所增加，杂交号的强度也有所增强。
70年代末80年代初、人们构建了一些BR322的衍生质粒，随即提出了其复杂件和低效性的问题。这些质粒缺少与控制拷贝数和转移性相关的辅助序列。不幸的是，在第一代高拷贝数的质粒中，最著名的pXf3(Hnanhan1983)和pAT53(Twigg and Sher-ratt 1980)出现了一个严重的缺陷:外源DNA序列仅在位于构建质粒的“天然”序列内的限制位点上插入。在一两年内，这些质粒已经被一系列革命化的载体(pUC载体)所取代，在这些载体中，限制酶断裂位点的数目有所增加，在载体内的分布日趋合理Messing 1983:Norrander et al. 1983:Yanisch-Perron et al. 1985; Vieira and Messing1987。这些pUC载体是首先含有密集排列的一系列克隆位点的载体，称为“多接头”“多克隆位点”，组成能被限制酶识别的序列库。在大多数情况下，这些限制酶切位点都是单一的，即在质粒载体的其他部位无此位点。例如，pUC19载体上的多克隆位点由串联排列的13个限制酶切位点组成，包括:Hind、Sph、PsI、SalI、AccI、HincIXbaI、BamH、Smal、XmaI、KoI、SacI和EoRI.
多识别序列的这样一种排列方式提供了各种各样可供单独或联合使用的克隆靶位点，以便克隆用各种限制酶切割后产生的 DNA片段。进而，插入到其中一个限制切位点的片段，可用切点位于其侧翼的限制酶切制重组质粒而将其取出。因此，将DNA区段插入多克隆位点，相当于在其末端加入合成接头。这些侧位点大大简化了对外源DNA 区段进行限制酶切作图的工作。
将所有可能的克隆位点汇集于质粒的同一位置，其不利因素之一是不能利用选择标记的失活来筛选重组体。这种方法已经在第一代质粒，如pBR322中得到广泛应用，它携带有两个或多个不同的选择标记，如tetr和ampr，每个选择标记都含有一个“天然”的限制酶位点。外源DNA序列插入到其中一个位点即可使其中一个选择标记失活。因此，根据细菌能否在两组选择条件之中的一·组条件下生长，可区别含有重组质粒的细菌和携带空载体的细菌。
对于pUC载体而言，插入失活是不可能的。pUC载体仅携带有一个抗生素抗性的基因(以amp'为典型)，并且含有一组连续的克隆位点。然而，通过选细克隆的颜色可以轻易区分重组质粒和空质粒。pUC载体及其衍生载体都携带一个E.coli的DNA短片段，含有cZ基因的调控序列和半乳糖苷酶N端的146个氨基酸的编码信息，其多克隆位点嵌入到编码序列区段，恰好位于起始密码子ATG的下游。在转化的细菌中，pUC载体所表达的8-半乳糖苷酶N端的小片段没有内源性的半乳糖苷酶活性。然而，这一-被称作a片段的N端片段能够弥补8-半乳糖苷酶的某些突变，虽自身失活，但是可以产生富含催化活性的酶。当pUC质粒被引入到表达失活的半乳糖苷酶C端片段(w片段)的E.cli株中，α互补即产生。
当外源 DNA区段克隆到pUC载体的多克隆位点时，α片段的编码序列被破坏，a互补受到大大抑制或被破坏。因此，含有重组质粒的菌落具有ampr抗性，很少甚至没有8半乳糖苷酶的活性。虽然含有空质粒的菌落也是ampr抗性的，但能够水解非发酵的生色底物如 5-溴-4-氯-3.吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)(Horwitz etal.1964,davies andJacob1968;见信息栏“X-gal”和“α互补”)。因此，这两种类型的菌落可以通过简单的、非破坏性的组化方法加以区别(Mier 1972)。当琼脂培养基中含有X-gal时，携带非重组质粒的克隆将形成深蓝色菌落，而那些含有重组质粒的克隆或者形成普通奶白色菌落，或者形成蛋青色菌落。
1983年至今
质粒载体构建的最后阶段涉及到满足不同目的的辅助序列的联合应用，包括用于DNA 测序所需的单链DNA模板、外源DNA序列的体外转录、重组克隆的直接筛选以及大量外源蛋白质的表达。这些专门的内容在本章只进行简单的讨论，后面章节将有详细的阐述。
带有单链噬菌体复制起点的质粒载体
目前应用的许多质粒载体携带单链丝状噬菌体(如M13或f1)基因组的复制起点。这些载体，有时又称为噬菌粒，它们同时具备质粒和单链菌体载体的优点，并且拥有两种分离的复制模式的优势:即作为传统的双链DNA质粒，或作为产生噬菌粒单链拷贝的模板。因此，噬茵粒可以以相同的方式作为正相质粒载体，或者作为产生含有克除DNA区段的单链拷贝的丝状菌体颗粒。自80年代初期开始使用以来噬菌粒已经不常用于将质粒中的外源DNA区段亚克隆到传统的单链体载体上。当带有噬菌粒的细菌感染辅助噬菌体(体)时，单链DNA即被诱导产生，该辅助噬菌体需携带的基因包括能从双链模板产生单链DNA及将单链DNA包装进入丝状病毒颗粒的基因。将感染细菌少量培养所分泌的缺陷型丝状病毒就含有足够测序用的的单链DNA。
在多数情况下，有噬菌体复制起点方向不同的成对质粒载体可资利用。复制起点的方向决定两条 DNA链中的哪一条链被包装入噬菌体颗粒。习惯上，用加号(+)表示质粒的起点，在嘡菌体颗粒中亦是如此。
带有噬菌体启动子的质粒载体
许多质粒载体在多克隆位点的邻近位置上带有来源子T3、T7和SP6菌体的启动子。因此，当将线状重组质粒DNA与相应的依赖于DNA的RNA聚合酶和核糖核苷酸前体一起温育时，通过限制酶酶切位点插入到多克隆位点内的外源DNA可以在体外得到转录。这些启动子的特异性很强，例如来源于SF6菌体的RNA聚合酶不能从位于该质粒其他区域的其他噬菌体启动子合成RNA。
许多商品化载体(如pGEM或Bluescript系列载体)带有两个反向的、位于多克隆位点两侧的噬菌体启动子(Short etal，1988)。这种构架允许从外源 DNA的任一条链或任一端在体外合成RNA，这种选择依赖于转录反应中所用的RNA聚合酶的类型。以这种方式产生的RNA可用作杂交探针，也可以在无细胞蛋白质合成体系中进行翻译。此外，带有T7启动子的载体可以被用来在表达T7RNA聚合酶的细菌中表达克隆化的DNA序列(Taborand Richardson 1985)。
正相选择载体
鉴定有DNA插入的质粒可能既伤神，又费时。不过，已经出现了多种克载体它们只让仅带有重组质粒的细菌得以生长(综述见BurnsandBcacham1984;Hengen1997)。在选择条件下，含有空质粒的细菌不能形成菌落。通常在这些系统中所使用的质粒可以表达一种可使某些宿主菌致死的基因产物，而当一段外源 DNA被克隆到该质粒后，该基因失活并失去毒性。例如，Bochner等(1980)、maloy和Nunn(1981)及Craine(1982)报道，在一定条件下，带有编码tet'基因的质粒载体的转化细菌不能生长，而由其te:”基因内插入一段外源DNA的重组质粒所转化的细菌却可以生长。用于各种正相选择载体的其他条件致死基因包括:编码入菌体阻抑物的基因(Nilssonetal.1983;Mongolsuket al.1994)、EcoRI甲基化酶基因(Cheng and Modich 1983)、EcoRI内切酶基因(Kuhnetal.1986)、半乳糖激酶基因(Ahmed 1984)、大肠杆菌素E3 基因(Vernet et al.1985)、转录因子 GATA-1基因(Trudel etal.1996)、中X174 的裂解蛋白基因(Henrichand Plapp1986)、大肠杆菌的ccdB基因(Bernard 1995，1996)、芽孢杆茵RNA酶基因(Yazyninetal.1996)。尽管这些正相选择系统可能设计得很巧妙，但是被广泛应用仅有少数几个。在许多情况下，克隆位点的数目通常是有限的，选择的效率可能时高时低，常常需要特定的宿主细胞，而且所用质粒中往往缺乏一些理想的特性，如嗞菌体启动子和 M13 菌体的 DNA复制起点。于是，大多数研究者宁愿通过其他的方式降低空质粒的背景，如优化在连接反应中载体DNA与插入片段的比例，将载体去磷酸化，或采用定向克隆等。随后，含有预期重组子的菌落可以通过放射性标记探针的原位杂交、小量制备质粒后的限制酶分析及插入片段的PCR扩增来鉴定。
低拷贝数的质粒载体
传统的高拷贝数质粒载体携带有各种coIE1复制子;相反地，低拷贝数的质粒载体带有如R1之类的复制子，因而只能在非常严谨的条件下维持质粒DNA的合成。
第一代的低拷贝载体，按今天的标准丽言可算是相当巨大而粗糙，它们曾被用来解决特定的外源基因和DNA序列克隆到质粒中后出现的毒性问题。编码膜蛋白和DNA结合蛋白的许多基因属于此类，某些启动子和调节序列也是如此(参见Fietal.1979; Hansen and von Meyenberg 1979;iittle 1979; Murray and Kelley 1979; Beck andBremer 1980;Claverie-Martinetal.1989)。有时这些DNA序列和基因产物对宿主菌的毒性太大、以至于用高拷贝数的载体分离转化的菌株简直是不可能的。即使获得了转化子，它们的生长速率通常极低，克隆化的外源 DNA序列也不稳定。为解决这类问题已经建立了多用途的低拷贝数载体，它们不仅带有受到严格调控的原核启动子，仅维持低水平本底表达(如pET系列载体)，而且携有防止外源DNA序列从上游质粒启动子过多转录的原核转录终止子。现在这些低拷贝数的载体被添上了多克隆位点、单链噬菌体的复制起点、T3和T7的启动子和其他有用的调节子。现有的多数低拷贝数载体也携带par基因座,它在细胞分裂过程中促进质粒分子在子细胞中的精确分配。质粒不稳定的问题也可以通过使用能抑制 coIE1质粒复制的大肠杆菌菌株来解决。用做coE1质粒的宿主的大多数大肠杆菌，菌株都带有一个野生型基因，称为cnB，它编码poly(A)聚合酶。通过在RNAT的3'端加入腺苷酸，野生型pcnB基因可促进RNAI的降解和降低coIE1质粒的拷贝数。多聚腺苷酸化的RNAI高度不稳定，因而它便不能防止RNAI的形成，后者是质粒DNA合成的引物。在负载有突变型cB基因的大肠杆菌菌株中，RNAI米被腺苷酸化，因而其半衰期得以延长;于是RNAI的加工受到抑制，colE1质粒的拷贝数降到几十以下。在传统的大肠杆菌宿主中不稳定的许多重组coE1质粒，可以在pcnB的突变菌株中成功生长(Heetal.1993;Elisetal.1995;Podkovryov and Larson 1995;Pierson and Barcak 1999)。
失控复制的质粒载体
失控载体在温度超过34℃时以正常方式复制，其拷贝数随着培养温度的增加而增加，至 39℃时，质粒的复制变得无法控制。来自于低持贝数IncFⅡ质粒R1的载体，可通过人为增加repA mRNA合成速率来使其转化为失控载体，如使epA基因受到入噬菌体 p 和p,启动子的控制，而该启动子的活性又受到温度敏感的入阻遏物cI857来的调控(综述见Nordström and Uhiin 1992)。由于失控扩增发生于蛋白质合成过程因而克隆到失控复制的质粒中的外源 DNA 表达产物可能最终构成一个细菌细胞的 50%的蛋白质(Remautetal.1983)。
失控质粒的复制及与其相关的质粒编码蛋白的产生给宿主细胞带来严重的代谢限制，如生长速率降低，有时甚至导致细胞死亡(UhlinandNordsreom1978;Uhlin et al1979;Remaut et al.1983)。基于这个原因，把好诱导时间对于最大产量的获得完整靶蛋白是颇为重要的。
质粒表达载体
大量含有强启动子的质粒载体已被构建成功，这些启动子在体内可由克隆化的外源基因产生大量的mRNA。目前许多这样的启动子的活性受到严格调节，以致在抑制条件下靶基因维持最低水平的基础表达，在培养条件下，由于某些简单的变化克隆化基因的表达受到迅速而强烈的诱导。如果要产生大量活性蛋白质，载体上起始密码子ATG的上游必须含有有效的 Shine-Dalgarno 序列。外源蛋白质能否达到最大的表达量，关键在于 Shine-Dalgarno序列与ATG密码子之间的距离(Shine and Dalgarno 1975)。
多数情况下，质粒表达载体用于表达不含有任何原核序列的外源蛋白质;然而更为常见的是，表达载体产生融合蛋白，该融合蛋白的一部分由载体编码，而另一部分则由克隆化的外源 DNA的可读框所编码。因此，该外源蛋白以融合多肽的形式合成，它含有一段在正常状态下不属于活性蛋白的氨基酸。在早期的分子克隆中，这段外源氨基酸大得足以使所研究的蛋白质的生理和生物性能产生强烈的改变，其溶解性和稳定性可能提高或降低，这至少在某种程度上提供了认识该蛋白质的各种生物特性的好机会。
近几年来，由载体贡献的序列迅速变小。它们的长度大多少于12个减基，通常并不影响所研究的蛋白质的功能。这些“标记”蛋白通常是抗原决定(抗原表位)，可被特异的抗体识别。利用存在的抗原表位特异抗体可以纯化表位标记蛋白(综述见Kolodziej and Young 1991;Keesey1996)。在各种各样的表达蛋白中，可用同一抗体来检测抗原标记。
寻找适合特殊用途的质粒载体
当寻找一般或广泛应用的五花八门的质粒时，首先应该查阅商品目录。这些公司提供的产品经常已将标志物、调节子、克隆位点和抗原表位进行了合适的组合，使用时不必再加工。这些载体产品已在多家实验室的多种条件下得到验证，让它们良好工作并不太难。
不幸的是，描述具有特殊性能、适于特殊目的质粒载体的文献并不容易获得。显然，使用带有逻辑运算符AND、OR和NOT并能进行布尔(Boolean)检索的数据库如 Medline、Entrez和 PubMed,将大有神益。例如，用(p15Aor IncFⅡ)[TW]ANDT7[TW]AND low-copy-number 作为检索词，搜索以 Medline 为基础的数据库，可以得到标题含“low-copy-number”，正文含有“T7”，以及“p15A”或“IncFⅡ”的一串参考文献。此外，描述特异的或新质粒载体的文章通常发表在诸如Gene、BioTechnology的杂志上。一旦一到两篇有意义的文章已经通过科研文献或布尔检索所鉴定，就被作为扩大数据库检素的起点，成为同样的或密切相关的课题的额外文献。
人们从不知道从文献来的载体是否可以做得像广告所说的一样，或者它是否是目前最适用的。文章的作者通常能够就此提出敏感的建议。但要小心人们是否已开始讨论对已发表的载体正在进行改进。显然，最初的载体不能做得如广告所说的那样;升级的版本很可能也不太好。如果可能，应该找出已经用过这个载体或可能已找到鉴定和解决此何题的方法的其他研究者的名字。
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更新日期：2024-06-25
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编制人：木木