限制性内切酶酶切技术及其在DNA图谱构建中的应用

引言

限制性内切酶酶切技术作为分子生物学领域的基石之一，对于DNA片段的精确切割和功能分析至关重要。本指南深入探讨了限制性内切酶的分类、作用机制以及如何利用这些酶构建DNA的物理图谱，即限制性内切酶酶切图谱。通过详尽的实验步骤和注意事项，本文旨在为研究人员提供一个全面的操作框架，从酶的选择与保存、反应条件的优化到电泳检测的标准化流程，确保实验的高效与准确性。此外，我们还将阐述如何通过双酶切策略和优化酶切条件来提高图谱的分辨率，进而应用于基因组研究、基因克隆和遗传多样性分析等多种科学探索中。

限制性内切酶是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的类内切酶。它可分为三类：Ⅰ类酶和Ⅲ类酶兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机地切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类酶由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类酶中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4~6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoR Ⅰ识别6个核苷酸的序列：5'-G↓AATTC-3'），有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如Sma Ⅰ：5’-CCC↓GGG-3'）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段，称黏性末端，如EcoR Ⅰ切割识别序列后产生两个互补的黏性末端。

5'-G↓AATTC-3'→5'-G AATTC-3'

3'-CTTAA⬆G-5'→3'-CTTAA G-5'

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的枪头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚:氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30min，离心、干燥并重新溶于缓冲液后，进行第二个酶切反应。

DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节。近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。

构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。

在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5~ 1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度（大多数为37℃）。对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1U酶，消化1~2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2~3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。

一、实验材料

（1）限制性内切酶 BamH I和Xho I（购自TaKaRa公司），-20℃保存。BamH I和Xho I均可用H缓冲液，为10倍浓缩液。

（2）PCR产物，质粒DNA。

（3）灭菌水，限制性内切酶，上样缓冲液，琼脂糖，溴化乙锭。

二、实验仪器

电泳仪，电泳槽，上样梳，微量移液器，微波炉，离心机，恒温水浴锅，三角烧瓶，冰盒，EP管，一次性手套等。

三、操作步骤

1、单酶切

限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2mL/0.5mL的EP管中进行。

（1）配制反应体系 20μL反应体系如下：

DNA                                 0.2~1μg

10x酶切缓冲液                 2.0μL

限制性内切酶                   1~2U

ddH2O（灭菌去离子水） 至 20μL

配制过程中需注意以下问题。

①酶的保存 限制性内切酶在合适的缓冲液中置于-20℃保存。

酶贮存液【参照宝生物工程（大连）有限公司说明书】：10mmol/LTris-HCI（pH7.5），100mmol/L KCl，0.1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，0.01% BSA，0. 15% TritionX-100，50% 甘油。

②酶活性单位（U）定义《分子克隆实验指南》通常将1U酶定义为：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应体系中反应1h，使1μg DNA 完全消化所需的酶量。宝生物工程（大连）有限公司说明书将1个活性单位（U）定义为，在50μL反应体系中，37℃下反应1h，将1μg的λDNA完全分解的酶量。

③酶切缓冲液组成 酶切缓冲液经常由生产酶的厂家同时提供，建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。

（2）限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心。

（3）放置于最适温度水浴温育一定时间，一般为37℃水浴反应1~4h。

（4）（可选）加入终浓度为10mmol/L的0.5mmol/L的EDTA（pH8.0），或将反应管在65℃水浴放置10min以终止反应。

（5）取适量质粒酶切产物，加2μL的10x上样缓冲液混匀，以未酶切质粒或/和酶切的空载体作对照，电泳检测。有时需要纯化回收，可用酚:氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀 DNA。

2、双酶切

酶切反应一般在灭菌的0.2mL/0.5mL的EP管中进行。

（1）配制反应体系 20μL反应体系如下：

PCR产物           0.2~1μg

10x酶切缓冲液  2.0μL

BamH I             0.5~1U

Xho I                 0.5~1U

ddH2O              至 20μL

（2）步骤同1中单一限制性内切酶酶切（2）~（5）。

（3）操作注意事项：

①通用缓冲液的选择

②有些内切酶所要求的缓冲液比较特殊，需要进行分步酶切，即按顺序用不同的内切酶酶切。

③按照先低盐（缓冲液）和低温（反应温度）、后高盐和高温的原则进行；如果盐浓度和温度有冲突，应该先进行低盐的反应。

3、大体积酶切反应

在一些实验中，要求得到大量纯化的经酶切处理的片段时，可以按比例加大反应体系，比如50~200μL。

四、技术要点

（1）浓缩的限制性内切酶可在使用前以1x限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释，以免酶变性。

（2）限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。

（3）尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。商品化的内切酶浓度一般在10U/μL，0.5μL酶量足以完成反应。

（4）通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。

（5）在反应条件不适时，某些内切酶会出现星号活性，即其切割特异性发生改变。 必须对此加以注意，避免星号活性出现。

（6）DNA 制品中的污染（如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓度）均能抑制内切酶活力；消化超螺旋 DNA较线状 DNA 需要酶量大。

参考文献：分子微生物学实验指导

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更新日期：2024-06-06

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