培养基的制备——普通牛肉膏蛋白胨固体培养基

一、实验目的

（1）了解配制微生物培养基的基本原理

（2）学会玻璃器皿的洗涤和各类物品的包装和灭菌的准备工作。

（3）掌握培养基配制和无菌水制备方法。

二、基本原理

大多数微生物均可用人工方法培养。培养基是根据微生物的营养需要，将水、碳源、氮源、无机盐及各种生长因子等按一定比例人工配制而成的营养基质，调整适宜的pH高温灭菌后，主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。多数培养基采用一部分天然有机物作为碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品配制，属于半合成培养基，其特点是使用含有丰富营养的天然物质，再补充适量的无机盐，配制方便，又能满足微生物的营养需要，大多数微生物都能在此培养基上生长。

三、实验器材

（1）培养皿、试管、吸管、锥形瓶、吸耳球、烧杯等。

（2）纱布、棉花、报纸、牛皮纸。

（3）pH试纸（6~8.4）、洗液、10%的盐酸、10%氢氧化钠溶液。

（4）牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。

四、实验内容

（一）玻璃器皿的洗刷与包装

1、洗刷

玻璃器皿在使用前要进行洗刷。培养皿、试管、锥形瓶等可先用去污粉或肥皂洗刷，然后用自来水冲洗。吸管可以用洗液浸泡，再用水清洗。洗刷干净的玻璃器皿可放在烘箱中烘干。

2、包装

（1）一套培养皿由一底一盖组成。按实验所需的套数一起用牛皮纸包装。

（2）吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花，构成1~1.5cm长的棉塞，以防细菌吸进口中，并避免将口中的细菌吹入管内。棉花要塞的松紧适宜，吸时既能通气又不会使棉花滑入管内。将塞好棉花的吸管尖端放在4~5cm宽的长纸条的一端，吸管与纸条约成45°，折叠包装纸包住尖端，用左手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，纸条即旋转式包在管子外面，余下部分折叠打结。按照实验需要，吸管可单支包装或多支包装，以备灭菌。

培养皿和吸管也有放在特制容器内灭菌的。

（3）棉塞的制作：按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺开，中间厚、周围逐渐变薄，近似正方形。折起铺开的棉花的一角（成五角边形），再将棉花卷成一端粗一端细的棉花卷，之后用纱布包裹棉花卷。这样，棉塞就做好了（图1）。

图1、棉花塞的制作

（4）试管和锥形瓶等的管口或瓶口均需用棉花堵塞。将棉塞细端塞入试管或锥形瓶的口内，四周应紧贴管壁和瓶口，不留缝隙，以防空气中微生物沿棉塞皱褶进入。棉塞不能过松或过紧，以手提棉塞，管、瓶不掉下为准。棉塞的2/3应在管内或瓶口，上端露出少许，以便拔出。棉塞的大小及形状应如图2所示。在制作培养基的过程中，如不小心将棉塞粘上培养基，应用清洁棉花重做。

图2、对棉塞的要求

待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包装，并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内以备灭菌。

（二）培养基的制备

1、步骤

（1）配制溶液。按培养基的配方，称取各种原料。取适量的烧杯盛所需的水量，依次将各种原料加入、溶解。难溶解的原料如蛋白胨、肉膏、琼脂等需加热溶解。当原料全部溶解后应加水补充因蒸发所损失的水量。加热时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。

（2）调整pH。用pH试纸测定培养基溶液的pH，按要求以10%盐酸或10%的氢氧化钠溶液调整到所需的pH。

（3）过滤。用纱布或棉花过滤均可，如培养基的杂质很少，可不过滤。

（4）分装。据不同需要，将培养基分装在试管和锥形瓶内。要使培养基直接流入管内和瓶内，注意不要污染管壁，并避免沾湿棉塞造成污染。

试管的分装。取一个玻璃漏斗，装在铁架上；漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹；松开弹簧夹，使培养基直接流入试管内（图 3）。

图3、分装培养基

装入试管培养基的量视试管大小及需要而定。若所用试管大小为15mm×150mm时，液体培养基宜分装至管高的1/4左右；如果分装固体或半固体培养基，在琼脂完全融化后，应趋热分装，用于制作斜面的固体培养基的分装量一般为管高的1/5（3~4mL）；半固体培养基分装量宜为管高的1/3左右。培养基分装后，塞好棉塞，用防水纸包扎成捆，贴上标签。

锥形瓶的分装。用于振荡培养微生物时，可在250mL锥形瓶中加入50mL液体培养基；若用于制作平板培养基时，可在250mL锥形瓶中加入150mL液体培养基。

（5）斜面培养基的制作。将装有琼脂的培养基的试管进行灭菌后，趁热搁置在木条或木棒上，使试管呈适当的斜度（图4），待培养基凝固。

图4、斜面的制作

2、普通牛肉膏蛋白胨固体培养基

它是一种固体培养基，本实验制备后可供测定细菌总数使用。

此固体培养基成分如下：蛋白胨2.5g、牛肉膏0.75g、氯化钠1.25g、琼脂2.5~5g，最后加蒸馏水至250mL。

此固体培养基制法如下：①将上列成分混合后，煮沸到琼脂完全溶解，在加热过程中要不断搅拌；②用蒸馏水补充蒸发损失的水分；③调整溶液的pH为7.4~7.6；④趁热用纱布过滤，并分装在试管中，每管装10~15mL。如装在锥形瓶则要用250mL锥形瓶，以每瓶装100mL左右为宜。管口或瓶口均用棉花塞住；⑤置高压蒸汽灭菌器中，以121℃灭菌20分钟，然后储存在阴暗处备用。

（三）无菌水的制备

在试管或瓶内先盛适量的自来水，使其灭菌后水量恰为9mL或99mL，此种适量的水体积可在灭菌器内由实验求得。也可先将管或瓶灭菌，再用灭菌的吸管取灭菌的自来水9mL或99mL加入管或瓶中。无菌水常用来稀释水样。

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更新日期：2024-06-13

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编制人：冬冬