实验指南 | 感受态细胞制备方法

1.实验目的

(1)熟悉感受态细胞生理性质,熟悉相关试剂的配制和作用。

(2)掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。

2.实验器材

移液器、高速离心机、恒温振荡器、恒温培养箱、普通冰箱、分析天平、1.5mLEppendorf 离心管、微量移液器、三角烧瓶、酒精灯、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、葡萄糖。

3.实验原理

细菌细胞的感受态,一般是指利用细菌生长过程中的某一阶段的培养物,能够作为转化的受体,接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质和酶,负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。制作感受态细胞是把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌的前提。感受态细胞在微生物分子生物学中常常用到,是微生物遗传性状改造的重要方法。能发生感受态的细胞占细菌的少数,同时,细菌的感受态状态是在短暂时间内发生的。

目前对感受态细胞能接受外源DNA分子的原因尚未有统一结论。主要有两种假说:

(1)局部原生质体化假说。细胞表面的细胞壁结构发生变化,局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使外源DNA分子能通过质膜进入细胞。支持这种观点的主要证据有:发芽的芽孢杆菌容易转化;大肠杆菌的原生质体不能被菌体感染,却能受噬菌体DNA转化:适量的溶菌酶能提高转化率。

(2)酶受体假说。感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点,使DNA分子可以进入细胞。支持这种观点的主要证据有:蛋白质合成的抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用:细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期的中早期出现;分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。

4.实验步骤

(1)将大肠杆菌细胞接种于LB斜面培养基上,进行活化,置于恒温培养箱中37℃培养过夜。

(2)用接种环接种培养出的大肠杆菌菌落培养物,接种于有5mL液体LB的玻璃试管中,于恒温振荡器上,37℃振荡培养过夜(约16h),可在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致,有无杂菌污染。

(3)在无菌超净台用微量移液器,吸取过夜培养的1m菌液,接种于盛放在250mL锥形瓶的100mL液体LB培养基中,分别按照1%、2%和5%的接种量进行接种,在37℃恒温振荡器上培养2~3h。

(4)从三个锥形瓶中分别取1mL培养液,以未接种的LB作空白对照,在550nm处,利用分光光度计上测OD550的吸光度值,待吸光度值约为0.5.停止培养,开始制备感受态细胞。

(5)在无菌超净台用微量移液器,吸取1m菌液,转移到1.5mLEppendor离心管中。

(6)将离心管置于冰上10min,冷却菌液,置于台式冷冻离心机上,3500rpm离心 5min。

(7)无菌条件下,倒去上清LB,倒斜离心管,让LB流干,留下菌体沉淀,加人预冷的100mmol/LCaCl₂,溶液800mL,用微量移液器轻轻吸冲底部沉淀菌体,使菌体充分悬浮后,摇匀后于冰浴中放置30min。

(8)重新将CaCl₂,菌悬浮液置于台式冷冻离心机上,3500rpm离心10min,小心侧倒掉上清 CaCl₂,,保留菌体沉淀。

(9)将菌体悬浮在200mL100mmol/LCaCl₂,的溶液中,置于冰上作为转化的受体菌液。这种方法制备的感受态细胞在制备后1~24h内使用,转化效率较高。

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更新日期：2024-05-28

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编制人：木木