实验指南 | 质粒的提取

1.实验目的

(1)了解质粒提取试剂的配制

(2)掌握质粒提取的方法

2.实验器材

移液器、高速离心机、分析天平、1.5mL Eppendorf离心管、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、葡萄糖、Tis、EDTA、NaCI、NaOH、SDS、KAc、冰醋酸。

相关试剂的成分:

(1)Solution I:50 mmol/L葡萄糖,25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),10 mmol/LEDTA(pH 8.0),高压灭菌后,4℃保存备用。

(2)SolutionⅡ(现用现配制):0.2 mol/L NaOH,1% SDS。

(3)Solution Ⅲ(100 mL):5mol/L KAc 60 mL,冰醋酸 11.5 mL,水 28.5 mL，配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L 钾盐、5 mol/L 醋酸(pH 4.8)。

3.实验原理

质粒在工程菌研究中非常重要,是现代食品生物技术基因工程操作中常用的载体。质粒的提取技术是利用质粒载体的前提。质粒在细胞中一般以供价闭合环的形式存在,压缩程度很高,通过碱裂解法将细胞裂解后,加入SDS使染色体DNA与细胞蛋白一起形成沉淀被抽提掉,而质粒则存在于溶液中,将染色体DNA与质粒分离后,进一步可从上清中回收纯化到质粒DNA。

4.实验步骤

(1)用灭菌的牙签挑取单菌落放人50mLLB液体培养基(含Amp0.1mg/mL)中.37℃振荡培养过夜。

(2)将菌液倒人1.5mLEppendorf管中,10000pm离心1min,去掉上清液重复两次。沉淀悬于200mLSolutionI中，涡旋使充分悬浮。

(3)加入 300μL, SolutionII,混匀(注意动作轻),冰箱3 ℃放置 5min。

(4)加人300μL SolutionIII,混匀(注意动作轻),冰箱3℃放置 5min。

(5)12000rpm,离心5min,将上清移至1个新Eppendorf管中,注意所取体积(约600μL)。

(6)加入等体积氣仿(约600L),混匀(注意动作轻)。12000rpm,4℃,离心10min,取上清液。

(7)上清液中加人预冷的等体积异丙醇,-20℃沉淀20~30min。

(8)12000rpm 离心15 min。

(9)去上清,沉淀加500μL70%乙醇洗涤2次(12000rpm离心3min)。

(10)去掉上清(注意沉淀勿丢失),室温或真空干燥沉淀。

(11)每管中加人25μL无菌水1μL RNase,37℃溶解质粒 DNA。

敬请关注“灰藻视界”，共筑健康未来！
— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，共创生命科学的美好未来！

更新日期：2024-05-27

#创作团队

编制人：木木