实验指南 | 细菌总DNA的提取

一、实验目的

(1)了解DNA的提取原理。

(2)掌握细菌总DNA的提取过程

二、实验原理

DNA作为遗传信息的载体,DNA的提取是分子生物学技术中最基本、最常规的工作。目前,细菌总 DNA 制备的具体方法很多,针对不同的环境样品,DNA 提取的步骤往往不是完全相同,但都包括一些基本步骤:先裂解细胞,再除去样品中的蛋白质、RNA、多糖等杂质,纯化 DNA。目前,市场上有许多种针对不同样品的 DNA 提取试剂盒在售,为了便于掌握DNA的提取过程及提取原理,该实验以传统的手工提取法为例,介绍 DNA 提取的基本过程。

1.细胞裂解

因为细菌都带有细胞壁,特别是革兰氏阳性菌,由于细胞壁较厚,可先在碱性环境下用溶菌酶降解细胞壁后,再用十二烷基磺酸钠(SDS)裂解细胞。对于革兰氏阴性菌,细胞壁肽聚糖层较薄,有时可不用溶菌酶,直接采用SDS裂解细胞。

溶菌酶能够水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键,破坏细胞壁的肽聚糖结构,导致细胞壁的破裂。

SDS是一种较强的表面活性剂,能够溶解细菌细胞膜上的脂类和蛋白质,从而使细胞裂解。而且还能够解聚细胞中的核蛋白,释放 DNA。

如果样品中含有一些特殊的物质,可能会影响 DNA的质量或后续的PCR过程，-般需要另外加入用以去除这些物质的试剂,如,含有较多腐殖酸的土壤样品,腐殖酸会抑制 DNA 聚合酶的活性,影响 PCR 过程,所以,在提取 DNA 时往往需要在缓冲液中加人聚乙烯吡咯烷酮(PVP)以除去腐殖酸。

2.DNA 的纯化

细胞裂解后,DNA 样品中含有大量的 RNA、多糖、蛋白质等大分子物质,需要对其进一步纯化分离。

RNA 杂质一般可用 RNA 酶水解去除,RNA酶可以在破坏细胞壁之后紧接着加人,这样在后续步骤去除蛋白质的时候可以顺便把 RNA 酶当作蛋白质去除。

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为阳离子去污剂,在较高离子强度环境下,可与蛋白质和多糖(酸性多糖除外)相结合而使其变性沉淀。

饱和酚、酚:氯仿:异戊醇混合液以及蛋白酶等能够除去蛋白质杂质。其中,酚与氯仿属于非极性分子,能够使蛋白变性,相比来说,酚的变性作用更强,但是,酚在水中有一定的溶解度。由于酚易溶于氯仿等有机溶剂中,氯仿不溶于水,所以,氯仿在抽提过程中还有助于分相,酚与氯仿混合使用的效果较好。异戊醇的加人是为了减少气泡的产生。因为在提取过程中,为了使蛋白质去除效果更好,必须剧烈振荡,使溶液混合均匀,这个过程容易产生大量的气泡,从而影响有机相和蛋白质的相互作用,异戊醇能够降低分子表面张力,减少气泡的生成,同时,异戊醇还有助于分相。经过有机溶剂的作用,变性蛋白质密度增大,离心后与水相分离(DNA溶于水相),位于水相下部作为中间相,有机相相对密度最大,位于最下层。另外,蛋白酶K也可去除部分蛋白质用于生物样品中蛋白质的一般降解。

3.DNA 的沉淀与回收

DNA 的沉淀通常用乙醇或异丙醇。在溶液中,DNA是以水合状态稳定存在的乙醇能够以任意比与水混溶,与DNA争夺水分子,使其失水聚合。异丙醇疏水性较乙醇更强,也能很好地使核酸沉淀。它们的主要区别在于:

乙醇亲水性好,对盐类的沉淀较少,而且易于挥发,对后续实验的影响小。但是乙醇的加人量较大,沉淀所需时间较长。

异丙醇的加入量相比乙醇要少,且沉淀完全,速度快。但缺点是盐会与 DNA共沉淀,降低 DNA 的纯度,而且,异丙醇难以挥发除去,需要再用 70%的乙醇洗涤沉淀在除去异丙醇的同时也除去共沉淀的盐,使DNA进一步纯化。

另外,用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加人单价的阳离子,如NaCl或NaAc,因为在弱碱性环境下,DNA分子带负电荷,加入的Na⁺可以和DNA分子形成DNA 钠盐,减少DNA分子之间的相斥作用,易于聚合沉淀

4.DNA 纯度和浓度检测

由于 DNA 碱基具有苯环结构,在260nm 波长处有较强的吸收峰,吸光值的大小不仅与 DNA总量有关,还与其构型有关,因为构型的不同造成碱基的暴露程度不同一般来说,纯的DNA样品,当用1cm的石英比色皿测量时,1OD₂₆₀相当于 dsDNA 约为50μg/mL,相当于 sSDNA 约为 37 μg/mL,相当于寡核苷酸约为 30μg/mL。

但是,如果 DNA 抽提样品中含有RNA、蛋白质、酚等污染物时,DNA样品纯度检测一般需要测定DNA溶液的OD₂₆₀和 OD₂₈₀,通过计算 OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值确定样品的纯度。纯的 DNA样品的OD₂₆₀/OD₂₈₀≈1.8(经验值),若样品含有未去除干净的蛋白质或酚,该比值会略低(＜1.6),若样品中含有RNA污染,该比值会略高(＞1.9)。若样品纯度不高,可按下式估算DNA的浓度:

DNA的浓度(μg/μL)=OD₂₆₀×0.063-OD₂₈₀×0.036

(注:以上DNA 浓度的计算方法不适用于质粒DNA)

三、实验用品

1.菌种

大肠杆菌(Escherichia coli)。

2.培养基

LB培养基,配方如下:

胰蛋白胨     10g

酵母提取物     5g

NaCl     10g

水     1000mL

pH     7.4

3.试剂

(1)TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 8.0.

(2)SDS溶液:10%(m/V)。

(3)蛋白酶K:20mg/mL。

(4)RNase溶液:20μg/mL。

(5)NaCl溶液:5mol/L、0.7mol/L。

(6)CTAB/NaCl溶液:10%的CTAB(由0.7 mol/L NaCl溶液配置,可加热促其溶解)。

(7)酚:氯仿:异戊醇混合液:25:24:1(V:V:V)。

(8)氯仿:异戊醇混合液:24:1(V:V)

(9)乙酸钠溶液:3 mol/L,pH 5.2

4.实验器材

高速离心机、紫外可见分光光度计、微量离心管(1.5ml)、移液器、水浴锅、超净工作台、恒温振荡培养箱等。

四、操作步骤

(1)将大肠杆菌接种到LB液体培养基中,37℃恒温振荡培养至对数生长期。

(2)取1.5ml大肠杆菌培养液至微量离心管中,12000r/min离心20~30s,弃上清液。

(3)再用1mLTE缓冲液洗涤菌体两次,最后加人560LTE缓冲液,将菌体充分悬浮。

(4)在缓冲体系中依次加人30μLSDS溶液、3μL蛋白酶K和7μLRNase 溶液,混合均匀,37℃保温1h。

(5)再加人5mol/L的NaCl溶液100μL,混匀后,再加人80μLCTAB/NaCl溶液,65℃保温 10 min。

注意:混匀时应避免剧烈振荡，否则会使 DNA 链断裂。

(6)再加入等体积(780μL)的酚:氯仿:异戊醇混合液,混匀后,置冰浴中10 min.

(7)12000r/min 离心5 min,收集上层水相。

(8)再加人等体积的氯仿:异戊醇混合液,混匀后,再次离心5min,收集上层水相。

(9)加入 0.6~0.8倍体积的异丙醇,混匀,DNA 逐渐沉淀下来。

(10)用1mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀,12000r/min离心5min,弃上清液,并将离心管倒置于干净的滤纸上,使乙醇完全流出,再置室温下,让残余的乙醇自然挥发。

(11)再用一定量的 TE 缓冲液完全溶解 DNA 沉淀。

(12)取一定量的DNA溶液,用TE缓冲液适当稀释后,用1cm的石英比色皿在紫外分光光度计上测定溶液的OD₂₆₀和 OD₂₈₀,计算 OD₂₆₀:OD₂₈₀的比值,确定样品的纯度,并计算样品浓度。

注意:

为了提高结果的准确度,DNA溶液的OD₂₆₀值最好在0.2~0.8范围内，若浓度太高，需要预先稀释。

五、实验报告

(1)根据你的测定结果,计算 DNA溶液的浓度。

(2)你制备的 DNA样品的纯度如何?如果样品不纯,请分析原因。

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— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

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更新日期：2024-05-22

#创作团队

编制人：木木