实验指南 | 苏云金芽孢杆菌的发酵生产

一、实验目的和内容

（1）学习苏云金芽孢杆菌（简称Bt）发酵生产的基本方法、发酵过程中的中间检测方法、苏云金芽孢杆菌粉剂的产品检测。

（2）熟悉实验室发酵罐及其相关设备的使用和操作。

（3）学习发酵液对鳞翅目害虫的标准生物测定方法。

二、原理

近年来，针对化学农药日渐凸显的种种弊端，国内外生物农药的研发和应用发展迅速。已研制出一系列选择性强、效能高、无污染的生物农药。其中苏云金芽孢杆菌是研究很深入、开发历史较长、应用最为广泛、用量最大和效果最好的一类生物杀虫剂。苏云金芽孢杆菌是好氧的革兰氏阳性细菌，是包括许多变种的一类产晶体芽孢杆菌，可用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目，特别是鳞翅目的多种害虫。它在适宜的条件下能够利用廉价的农副产品迅速地生长，并能在较短的时间内产生杀灭很多农林业害虫的产物，发酵产物对人类及经济动植物无害，发酵液经济型化后可作为生物杀虫剂使用。苏云金芽孢杆菌的杀虫机理是在其芽孢形成过程中，同时也形成了具有杀虫活性的伴孢晶体，称为杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal pro-teins，ICPs）或δ-内毒素，昆虫摄取晶体蛋白后在昆虫中肠的碱性环境中被激活，破坏害虫中肠细胞而使其慢性中毒死亡。

苏云金芽孢杆菌的工业生产主要分为菌种培养、发酵、浓缩（离心或板框过滤）、干燥、剂型化、产品检验六道程序。目前，苏云金芽孢杆菌的大规模生产主要采用液体深层发酵。液体深层发酵是在液体培养基内部进行的微生物培养过程，液体深层发酵是现代发酵工业中使用的主要发酵形式。但固态发酵是苏云金芽孢杆菌生物农药生产的一种新方式。相较于液体发酵，具有培养基对环境污染少、易处理、能源消耗量低、技术设备简易、产物浓度高、后处理方便等优点。作为一项新型技术，固态发酵还存在着很大的发展空间。无论是液体发酵还是固态发酵，都需注意培养基中营养物质、PH、温度、含氧量的控制。对于苏云金芽孢杆菌的发酵生产，还需注意噬菌体的长期污染会降低产量。

三、仪器与药品

1、菌种

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，B.t.）菌种斜面。

2、培养基

（1）牛肉膏蛋白胨培养基

（2）液体种子培养基：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.1%，K2HPO4 0.08%，蒸馏水配制，灭菌前用1%NaOH调pH7.0。

（3）液体发酵培养基：胰蛋白胨1.0%，玉米粉0.5%，酵母膏0.2%，葡萄糖0.5%，K2HPO4 0.1%，KH2PO4 0.1%，pH7.0~7.2。

（4）发酵罐培养基：豆饼粉3.5%，玉米淀粉1.25%，酵母粉1%，K2HPO4 0.13%，MgSO4 0.02%，CaCl2 0.008%，MnSO4 0.008%。

3、生物测定供试虫

棉铃虫（ Helicoverpa armigera）初孵幼虫。

4、生物测定感染饲料

黄豆粉8g、酵母粉4g、抗坏血酸 0.5g、36%乙酸1.3mL、琼脂粉 1.8g、苯甲酸 0.1g、苯甲酸钠 0.3g。

5、生物测定缓冲液

NaCl 0.85 g、K2HPO4 0.6 g、KH2PO4 0.3 g、1%吐温-80 1 mL。

6、其他试剂

6%乳糖溶液、0.1 mol/L HC1、丙酮。

7、用具

三角瓶（100 mL、1 000 mL和 3000 mL）、显微镜、血细胞计数板、恒温摇床、离心机、精密pH 试纸、干燥箱、5L发酵罐等。

四、实验步骤

1、种子制备及检测

将保藏的菌种接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，28~30℃培养14~16h活化。用接种环取一环活化的菌种接入含有20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的100mL三角瓶中，于摇床250r/min，30℃下培养6~10h作为一级种子。亦可于活化后每管菌中加入5mL无菌水，制成的菌悬液作为一级种子。

种子的检测 （1）涂片镜检：无杂菌污染，形态正常，生长整齐的种子液为合格。（2）悬液法检测：大部分菌体运动缓慢或即将停止运动，为合适的移种时间。（3）噬菌体检测：针状噬菌斑不超过3个为合格。达到以上标准即可用于移种。

将培养好的一级种子按10%接种量转移到含200mL液体种子培养基的1000mL三角瓶中，于摇床250r/min，30 ℃下培养8~12 h。

2、实验室小规模扩大摇床培养

将培养好的种子，按5%接种量转移到含800mL液体发酵培养基的3000mL三角瓶中，摇床30℃下培养12~16h，定时取样镜检，分别用涂片、悬滴法检测菌体形态并计数。当培养至绝大部分芽孢形成，20%~40%孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体，菌数在20亿~25亿/mL左右时停止发酵。

3、小型发酵罐发酵

（1）按照发酵罐培养基配方及发酵液体积（一般按发酵罐体积的70%计）准确称量全部材料，加水待无机盐全部溶解后，调PH至8.0。

（2）将制备好的培养基倒入发酵罐中，再按一定比例加入微量消泡剂（如0.03%~0.05%泡敌），0.1MPa，121℃ 灭菌 30 min。

（3）待发酵罐中的培养基冷却至30℃，在罐盖上作接种用的接口处点燃火焰，以无菌操作把一级种子液迅速接入罐内。接种量约5%~10%，发酵条件为：发酵温度28~31℃，搅拌转数600~900r/min，通气量1:0.6~1:1.2vvm，发酵时间约 30 h左右。

4、发酵罐发酵过程的中间检测及发酵终止

发酵过程中每隔4~6h取样，测定pH，并涂片染色后用显微镜观察菌体生长发育形态，芽孢开始形成时记录同步率。当发酵液pH达8.0以上，培养至绝大部分芽孢形成，20%~40%孢囊破裂释放出芽孢和伴孢晶体，菌数在20亿~25亿/mL左右时停止发酵。

5、发酵液的杀虫活性测定（生物测定）

准确取一定量的发酵液，用生物测定缓冲液将发酵液分别稀释100倍、150倍、225倍、338倍和506倍5个浓度，每一浓度吸取3mL与27ml感染饲料充分混匀，倒24孔生测板，每块板挑入24头孵化不超过12h且未取食、健康活泼的幼虫，设两个重复；并设自然死亡率对照，置于 30℃恒温箱中饲养，72h后检查其死亡数，计算死亡百分率和毒力回归方程式，求出发酵液对棉铃虫的半致死浓度（LC50）。

6、苏云金芽孢杆菌粉剂的制备

（1）板框过滤：发酵结束，等罐压到零后打开罐盖，将填充料（碳酸钙）倒入罐内，搅拌均匀后，将发酵液压入板框，此时注意控制压力。压滤完毕后进行吹干，取出滤饼置烘干盘上50~60 ℃下烘干至水分达 4%以下。

（2）简单制备法：取出发酵液，用0.1mol/L HCI调pH至5.0左右。将以上发酵液4 000 r/min 离心 20 min，获得芽孢、晶体蛋白等沉淀物，将其移入蒸发皿中，于50~60 ℃下烘干，备用。

（3）乳糖丙酮沉淀法制备粉剂

将上述沉淀转至烧杯中，并悬浮于约为原液量1/2的6%乳糖溶液中，同时用玻棒用力搅抖20~30min。徐徐加入乳糖悬液4倍量的丙酮，边加边搅拌即有沉淀析出，静置使完全沉淀。抽滤去除丙酮，沉淀可再用少量丙酮洗2~3次，进一步去除杂质。将沉淀物置蒸发皿中真空干燥，或在 50~60 ℃下进行烘干，将其在研钵中磨碎便制成菌粉，其细度标准通常为 100 目过筛率达 95%以上。

7、产品检测

产品的指标为每克干粉制剂中所含芽孢数目。检测活芽孢数可用平板菌落计数法或血细胞计数板法。

（1）稀释菌液的制备：将菌粉0.5g放入装有灭菌玻璃珠的250mL三角瓶内，加入50mL无菌水，在摇床上振荡15min，使其均匀分散。样品即被稀释100倍（10^-2），然后继续用10倍稀释法稀释至10^-8。

（2）倾注平板记数法：用无菌吸管分别吸取10^-6、10^-7、10^-8稀释液各0.2mL，置于灭菌平皿中，再倒入熔化至45℃左右的灭菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，轻轻摇匀使成含菌平板，冷凝后倒置于30℃恒温箱中培养。每个梯度平行三次。24h后取出计数菌落，一般选择菌落在30~300个的平板计数，再以下式换算出每克菌粉的活芽孢数。

活芽孢数/g=菌落数目×5×稀释倍数

（3）血细胞计数板法：吸取高稀释度的菌液在血细胞计数板中进行芽孢计数，菌液浓度以计数板内每小格有3~4个芽孢为宜。

五、注意事项

严格无菌操作。以免污染杂菌。为防止噬菌体污染。可将一级种子于75℃下水浴20min以杀死噬菌体。

六、实验结果

（1）制表或图示发酵过程中菌体生长、pH、温度、溶解氧、搅拌速度及通风量的变化情况。

（2）发酵液的杀虫活性测定结果。

（3）苏云金芽孢杆菌粉剂产品检测结果。

总结

苏云金芽孢杆菌作为一种高效、安全的生物农药，其发酵生产与生物测定技术的研究对于推动农业可持续发展具有重要意义。通过本实验，不仅掌握了从菌种培养到产品检测的全过程，还深入了解了发酵过程中各关键参数的控制，以及如何通过生物测定评价发酵液的杀虫活性。此外，固态发酵作为潜在的发展方向，展现出优化发酵工艺、提高产物浓度和简化后处理流程的可能性，未来值得进一步探索与应用。通过持续的技术创新与优化，苏云金芽孢杆菌生物农药有望成为替代传统化学农药的重要选项，为保护生态环境、促进农业绿色转型贡献力量。

【相关资源】

名称：苏云金芽胞杆菌/Bacillus thuringiensis

菌株编号：HZB218208

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更新日期：2024-05-22

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编制人：冬冬