实验指南 | 生活垃圾可发酵物生物降解菌的筛选

一、实验目的和内容

（1）对生活垃圾可发酵物生物降解菌进行筛选，特别是研究其对纤维素的降解代谢能力。

（2）对各菌株除臭效果进行比较。

二、原理

城市生活垃圾组成复杂，其可发酵物包括易腐性物质如脂肪、蛋白质以及淀粉等，还含有较多数量的纤维素类物质，这些物质特别是纤维素类物质自然发酵时间长，使垃圾处理的负荷增加。垃圾堆肥技术工艺比较简单，适合易腐有机物含量较高的垃圾处理，可利用垃圾中的部分资源组分，对环境的影响远小于露天堆放、填埋、焚烧，处理费用远低于单纯的焚烧处理。但传统的简单堆肥技术耗时长，转化率不高。因此利用微生物好氧发酵，将垃圾制成无毒无害、营养丰富、成本低且不造成二次污染的绿色有机肥，是一种非常具有前景的处理垃圾的方法。

本实验对生活垃圾可发酵物生物降解菌进行了筛选。采集垃圾填埋厂土壤，通过刚果红染色法分离出微生物，筛选出降解率及除臭率较高的菌株。刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被降解菌中的纤维素酶分解后刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌（见图1）。

图1、三种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈

垃圾恶臭气体是多成分低浓度的混合物，按组成可分为5类：①含硫化合物，如硫化氢、二氧化硫、硫醇、硫醚；② 含氮化合物，如氨、酰胺、吲哚等；③卤素及衍生物，如氯气、卤代烃；④烃类，如烷烃、烯烃、炔烃、芳香烃；⑤含氧有机化合物，如醇、酚、醛酮、有机酸等。其中硫化氢（H2S）、氨（NH3）等是主要的臭气来源。

以铵氮含量及硫含量作为除臭效果考核指标，将上述筛选出的菌株接种于臭气提取物中，经发酵处理后，测定其铵氮含量及含硫量变化，对除臭效果进行比较。

三、仪器与药品

1、菌种采样地点

最好是垃圾填埋厂土壤。

2、培养基

（1）纤维素分解菌的选择培养基：纤维素粉5g，NaNO3 1g，Na2HPO4 ·7H2O 1.2g，KH2PO4 0.9 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KC1 0.5 g，酵母膏 0.5g，水解酪素 0.5 g，蒸馏水 1000 mL.。

（2）鉴别纤维素分解菌的培养基：CMC-Na 5~10g，酵母膏1g，KH2PO4 0.25g，琼脂15g，土豆汁100 mL，加水至1000 mL。

3、仪器

锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、移液管、天平、摇床、温度计、培养箱、高压灭菌锅、分光光度计等。

4、其他试剂

刚果红等。

四、实验步骤

1、纤维素降解菌的选育

（1）土样采集：土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

（2）选择培养：制备选择培养基。称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL选择培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1~2d，至培养基变浑浊。吸取一定的培养液（约5mL），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。

（3）梯度稀释：吸取0.1mL选择培养后的培养基进行梯度稀释10~10^6倍。

（4）涂布平板：将稀释度为10^-4~10^-6的菌悬液各取0.1mL涂布到鉴别纤维素分解菌的平板培养基上，30℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。

（5）刚果红染色法：方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/mL的刚果红溶液，10~15 min后，倒去刚果红溶液，加人物质的量浓度为1mol/L的 NaCl溶液，15 min 后倒掉 NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。方法二：在第四步之前，配制质量浓度为10mg/mL的刚果红溶液，灭菌后，按照每200mL鉴别纤维素分解菌培养基加入1mL的比例加入刚果红溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。

（6）纯化培养：将产生明显透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30~37℃下培养，可获得纯化培养。

2、各菌株除臭效果比较

将分离出的菌种接种于臭气提取物中。经发酵处理后，测定其氨氮含量及含硫量变化。

五、实验结果

汇总分离出的菌种的菌落形态、透明圈大小、氨氮含量、硫含量、除臭效果评价。

总结

本文详细介绍了针对生活垃圾可发酵物中纤维素降解能力的生物降解菌筛选实验及其除臭效果的比较分析。实验旨在通过筛选高效降解纤维素的微生物菌株，优化垃圾处理过程，同时评估这些菌株在降低垃圾产生的恶臭气体（如硫化氢、氨气等）方面的效能，为实现垃圾资源化、减量化和无害化提供科学依据。

参考文献：应用微生物学实验

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更新日期：2024-05-22

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编制人：冬冬