基因组DNA提取技术手册：微生物的全面指南

引言

基因组DNA不仅可以在动植物组织中取得，还可以从微生物中进行提取。本文系统地介绍了针对微生物的基因组DNA提取方案，并以丝状真菌和酵母为例，展示特殊生物体的DNA提取流程，包括详细的实验材料、设备、试剂、操作步骤以及后期的DNA检测方法，旨在为科研人员提供一套全面且实用的指南。

图1、DNA提取的简明流程

一、细菌基因组DNA的制备

1、实验材料

细菌培养物。

2、实验设备

移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。

3、实验试剂

（1）CTAB/NaCl溶液 4.1gNaCl溶解于80mLH2O，缓慢加入10gCTAB，加水至100mL。

（2）其他试剂 氯仿:异戊醇（24:1），苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K（20mg/mL或粉剂），5mol/L NaCl。

4、操作步骤

（1）100mL细菌过夜培养液，5000r/min离心10min，去上清。

（2）加9.5mL TE悬浮沉淀，并加0.5mL10% SDS，50μL 20mg/mL（或1mg 干粉）蛋白酶K，混匀，37℃保温1h。

（3）加1.5mL 5mol/L NaCl，混匀。

（4）加1.5mL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min。

（5）用等体积苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提，5000r/min离心 10min，将上清移至干净离心管。

（6）用等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提，取上清移至干净管中。

（7）加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，沉淀DNA。

（8）用玻璃棒捞出 DNA 沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于1mL TE，-20℃保存。如 DNA 沉淀无法捞出，可5000r/min离心，使DNA沉淀。

二、丝状真菌基因组DNA的制备

1、丝状真菌基因组的大量提取

（1）以每克经过滤抽干的菌丝体加4mL CTAB抽提液（2% CTAB；100mmol/L Tris-HCI，pH8.0；20mmol/L EDTA，pH8.0；1.4mol/L NaCl），加入2-巯基乙醇（2-ME）至终浓度为2%（体积分数）。

（2）菌丝体加入液氮冷冻，研磨至细小粉末状。把粉末加入到预热的2-ME/CTAB抽提液中，涡旋混匀，65℃保温45~60min，不时颠倒混匀。

（3）加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇溶液，颠倒混匀，12000r/min 离心 20min。

（4）取上层水相至另一离心管中，加入0.5~0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，4℃放置 20min，12000r/min 离心 10min。

（5）去上清，以70%乙醇洗涤沉淀两次，真空干燥后用适量TE缓冲液完全溶解。

（6）加入等体积冰预冷的5mol/ LiCL，混匀，12000r/min 离心 10min。

（7）转上清至另一新离心管中，加0.5~0.6倍体积冰冷的异丙醇，混匀，-20℃放置 20min，12000r/min 离心10min。

（8）70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥。

（9）以含50μg/mL RNase的超纯水完全溶解沉淀，37℃温育1h，-20℃保存备用。

2、丝状真菌基因组的小量提取

（1）约0.1g的菌丝体置于1.5mL的离心管中，加入300μL的提取缓冲液（100mmol/LTis-HCI，pH 8.0；100mmol/L EDTA；250mmol/L NaCl；1% SDS），用带塑料钻头的手持式电钻进行研磨约30s。

（2）加入等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提，12000r/min 离心 15min。

（3）取上清，加入0.6倍体积异丙醇，混匀，-20℃放置20min，12000r/min离心10min。

（4）70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥。

（5）以含50μg/mL RNase的超纯水完全溶解沉淀，37℃温育1h，-20℃保存备用。

三、酵母基因组DNA的制备

操作步骤如下：

（1）划线法在YPD平板上活化酵母菌，28℃培养，2天后长出单菌落。

（2）挑取活化的单菌落接种于5mL YPD培养基中，28℃，180r/min 振荡培养8~10h。

（3）移取1.5mL菌液至无菌EP管中，5000r/min 离心5min，弃上清。

（4）将菌体悬浮于0.5mL 1mol/L山梨醇，0.1mol/L Na2EDTA，pH 7.5的缓冲液中。

（5）加入0.02mL 10mg/mL消解酶溶液，37℃保温60~120min。

（6）10000r/min 离心 1min，弃上清，菌体重悬于0.5mL 50mmol/L Tris-HCL，20mmol/L EDTA（pH7.4）的缓冲液中。

（7）加入0.05mL10% SDS，混匀，65℃保温30~60min。

（8）加入0.2mL 5mol/L乙酸钾溶液，冰浴60min，12000r/min 离心 10min。

（9）移取上清至新的EP管中，加入 1/10体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃过夜沉淀，12000r/min离心10min，将沉淀用70%乙醇洗一次，室温干燥。

（10）将沉淀悬浮于100μL TE（pH7.4）缓冲液中，加入2μL无DNase 的10mg/mL RNase，37℃，保温 30min。

（11）提取的基因DNA用双蒸水稀释适当倍数后，在紫外分光光度计上测定OD260和 OD280，计算 DNA 纯度和浓度。OD260/OD280值介于1.8~2时，DNA 纯度较高。DNA浓度（μg/mL）=OD260值x50μg/ml x稀释倍数。DNA样品贮存于-20℃。

四、基因组DNA的检测

上述方法得到的DNA一般可以用作Southern、RFLP、PCR等分析。由于所用的材料不同，得到的 DNA产量及质量均不同。有时DNA中含有酚类和多糖类物质，会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后，均需检测DNA的产量和质量。

（1）DNA 溶液稀释20~30倍后，测定OD260/OD280比值，明确 DNA的含量和质量。

（2）取2~5μL在0.7%琼脂糖胶上电泳，检测DNA的分子大小。

（3）取2μgDNA，用10单位（U）Hind Ⅲ 酶切过夜，0.7%琼脂糖胶上电泳，检测能否完全酶解（做RFLP，DNA 必须完全酶解）。

如果DNA中所含杂质多，不能完全酶切，或小分子DNA多，影响后续的分析和操作，可以用下列方法处理：

（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。

（2）苯酚:氯仿抽提，去除蛋白质和多糖。

（3）琼脂糖凝胶柱过滤，去除酚类、多糖和小分子 DNA。

（4）CsCl梯度离心，去除杂质，分离大片段DNA（可用作文库构建）。

总结

本文综合介绍了细菌、丝状真菌和酵母基因组DNA的提取方法，不仅覆盖了从样本准备到DNA纯化保存的全过程，还强调了提取过程中应注意的关键点和质量控制措施。通过实施这些标准化操作流程，科研人员能够获得高纯度的基因组DNA，为后续的分子生物学研究奠定坚实基础。同时，提供的质量评估策略确保了DNA样品的适用性，无论是进行基本的遗传分析还是复杂的基因组学研究。

参考文献：Guide to experiments of molecular microbiology

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更新日期：2024-05-14

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