实验指南 | 无菌操作技术

一、实验目的

1.熟练掌握从固体培养物和液体培养物中转接微生物的无菌操作技术。

2.体会无菌操作的重要性。

3.掌握倒平板的基本操作方法。

二、实验原理

在微生物学实验或相关的科研生产中，经常需要把一种微生物菌种接种或移植到新鲜的培养基中。由于我们接种的微生物都是利用纯种的，所以接种工作都必须在无菌环境下(在无菌室或超净工作台)进行，并严格遵守无菌操作技术。一般情况下使用接种工具(如接种环、接种铲等)进行菌种的移植。在此过程中，无菌操作是进行接种培养微生物的关键。

常用的接种方法有:斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法。

1.斜面接种法

斜面接种，即把各种培养条件下的菌种接入斜面上(包括从试管斜面、培养基平板、液体纯培养物等中把菌种移接于斜面培养基上)。这是微生物学中最常用、最基本的技术之一。接种前，需在待接种试管上贴好标签，注明菌名及接种日期。接种最好在无菌室或无菌箱内进行，若无此条件，可在较清洁密闭的室内进行。

2.液体接种

液体接种是一种用接种环、移液管或滴管等接种工具将菌液通过无菌操作移接到其他培养基中的方法。吸管不同于其他接种工具，多为塑料制品不能烧，可预先对其进行其他灭菌。

3.穿刺接种

穿刺接种常用于细菌运动性的检查或菌种保藏。细菌、酵母菌的穿刺接种培养较多。用接种针蘸取菌种，移入装有固体或半固体培养基的试管中，自培养基中心垂直刺入到底，然后按原来的穿刺线将针慢慢拔出。

三、实验材料

1.超净工作台、接种环等接种工具、斜面培养基、酒精灯、酒精棉球等。

2.接种工具--接种环、接种钩、接种针、接种圈、接种锄、玻璃涂棒其他接种工具(图1)。

图1、常用微生物的接种工具

四、实验步骤

1.无菌操作要点

(1)首先要有微生物“无处不在”的意识。

(2)接种时要有一个洁净的环境，整个操作过程必须在火焰旁进行。

(3)接种环、棉塞一定要拿在手上，且不能碰到棉塞塞入试管中的部分更不能随便乱丢于操作台上。

2.用接种环转接菌种

接种细菌时先用接种针(环)来蘸取细菌标本(样品)，再进行接种。接种环与接种针大多为白金丝或合金丝所制成，也可用电炉丝代替，其特点为能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灼烧灭菌(当整个接种环烧红即达到灭菌目的)。

接种过程中，使用接种环时一般采用右手持笔式较易操作，左手拿培养基进行配合，其接种程序一般为:对接种环进行灼烧灭菌→冷却→蘸取细菌样品→进行接种(包括开盖或塞、接种画线、加盖或塞)→进行接种环灼烧灭菌等五个步骤。不同培养基，接种方法也不同。

具体操作如下(图2):

图2、接种环转接菌种操作示意图

A.接种前用酒精棉球擦净桌面。

B.将试管贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等，然后用酒精球擦手消毒。

C.点燃酒精灯以后，在火焰旁将每一支试管内的棉塞稍微转一下，使其松动，以便在接种时易拔出，并将试管放在试管架上，放在接种台的右前方。

D.将菌种斜面培养基和待转接的空斜面培养基的两支试管握在左手中，斜向上，并使它们呈水平位置，也可将试管横放在左手掌中央，用四个手指托住试管，大拇指压在试管上，斜面向上。

E.右手拿接种环，在火焰上将环的部分烧红灭菌，环以上凡在接种可能进人试管内的部分，均应通过火焰灼烧(见图3)。

图3、接种针灭菌

以下操作，需要使管口靠近火旁:

F.用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞。

G.以火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口，使试管口沾染的少量菌得以烧死。

H.将烧过的接种环伸入菌种试管内，先将环接触没有长菌的培养基部分使其冷却，以免烧死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种环抽出试管(图4)，注意尽量不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。

图4、从一支试管转接到另一支试管

从一支试管转接到另一支试管：

I.迅速将接种环在火焰旁伸进另一试管，在斜面培养基上从底部画线到顶部，但不要把培养基划破，也不要使菌种沾染管壁。

J.取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上，不要用试管去迎棉塞，以免试管在运动时灌人不洁的空气。

K.将接种环在火焰上再灼烧灭菌，放回原处后，再腾出手来将棉塞塞紧将新接种的斜面试管放在试管架上。

L.接种后的斜面培养基放在恒温箱内培养。

3.将液体培养基中的菌种接入液体培养基中。

接种工具:移液器、无菌移液管和无菌滴管。

移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌。

用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。

4.倒平板操作(图5)

当培养基冷却至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃条件下培养24~48h然后观察结果。

图5、倒平板

五、实验结果

操作:每组倒2皿高氏一号培养基，2皿孟加拉红培养基和6皿牛肉膏蛋白胨培养基(4个玻璃培养皿，2个一次性塑料培养皿)。

通过无菌接种技术每组各接一支大肠杆菌试管和一支金黄色葡萄球菌试管。

每组倒3种不同类型的培养基各3个平板以备下次实验使用。

参考文献：微生物学实验

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更新日期：2024-05-15

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编制人：木木