染菌载体在消毒效果评价中的应用——以白假丝酵母钢片载体为例

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　浏览量：25　　发布时间：2026-07-07 14:17:19

一、引言：载体定量杀菌试验的意义

消毒剂杀菌效果的科学评价，是保障医院感染控制、食品安全、公共卫生安全的重要技术支撑。在消毒学试验中，根据染菌方式的不同，主要分为悬液定量杀灭试验和载体定量杀灭试验两大类。

悬液定量法将试验菌直接悬浮于消毒剂溶液中，虽然操作简便、重复性好，但并不能真实反映消毒剂在实际物体表面的作用情况——现实中的微生物总是附着在各种材质的表面上，而非悬浮在液体中。

载体定量杀菌试验正是为解决这一局限而设计的。该方法将试验菌接种于与实际消毒对象材质相近的载体（如金属片、玻璃片、棉布片等）上，经干燥后使菌牢固附着，再与消毒剂接触，从而更真实地模拟现场消毒场景。这一方法尤其适用于对黏稠的消毒剂、冲洗用消毒剂等不宜用悬液定量法评价的产品。

中国《消毒技术规范》（2002年版）、GB/T 38502-2020《消毒剂实验室杀菌效果检验方法》以及国际标准ASTM E2197、EN 13697等均将载体定量试验作为消毒效果评价的重要方法。而染菌载体（即预制的“菌片”）作为这一试验的核心耗材，其制备质量直接决定着试验结果的科学性和可重复性。

染菌载体

图1、从“制备菌片”到“计算杀菌率”的全流程

二、菌种的选择：为何是这些微生物？

并非所有微生物都适合制成染菌载体。适合制成载体的菌株通常需要满足以下几个条件：

2.1 标准化的参考菌株

消毒试验所用的微生物应为标准菌株，具有明确的来源和稳定的生物学特性。《消毒技术规范》和GB/T 38502等标准中明确推荐了一系列标准菌株，分别代表不同类型微生物对消毒因子的抗力水平。例如：

• 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）——细菌繁殖体中化脓性球菌的代表

• 大肠杆菌（8099）——细菌繁殖体中肠道菌的代表

• 铜绿假单胞菌（ATCC 15442）——医院感染中常见分离的细菌繁殖体代表

• 白假丝酵母（CMCC(F)98001 / ATCC 10231）——致病性酵母菌的代表

• 枯草杆菌黑色变种芽孢（ATCC 9372）——细菌芽孢的代表，用于灭菌效果评价

2.2 良好的干燥耐受性

载体制备过程中最关键的一步是干燥——菌液滴加在载体上后需要在37℃温箱或室温下干燥20～60分钟。干燥过程本身会对微生物造成脱水胁迫，部分菌种会因此大量死亡。《消毒技术规范》明确指出：“细菌繁殖体在载体上干燥的过程中，可引起部分死亡，如铜绿假单胞菌在37℃干燥过程中，滴度最高可下降1个对数值”。

正因如此，只有对干燥具有一定耐受性的微生物才适合制成染菌载体。研究表明白假丝酵母（Candida albicans）在载体上干燥时，37℃干燥会显著影响其存活率，回收菌量远低于标准要求；而当载体在23℃室温下干燥时，即使干燥时间超过60分钟，白假丝酵母的存活率也能得到充分保证。这表明菌种的选择不仅要考虑其代表性和抗力水平，还要考虑其在实际制备工艺中的存活能力。

2.3 环境代表性

所选菌株应是在自然界、医疗机构环境或实验室设备上常见的污染菌，或是对消毒因子具有较高抗性的代表性菌株。例如白假丝酵母是人类最常见的条件致病性真菌之一，可在干燥无生命表面存活长达120天；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌则是环境消毒和卫生用品检测中最常涉及的指示菌。

三、载体的选择与制备

3.1 载体材质的选择

载体应根据消毒对象的实际材质来选择。常见载体包括：

• 不锈钢片：用于模拟手术器械、医疗设备等光滑硬质表面

• 玻璃片：用于模拟光滑表面，适用于荧光显微镜观察等特殊用途

• 棉布片：用于模拟织物、物体表面等

• 滤纸片：用于特定试验场景

• 聚四氟乙烯片：用于模拟非金属管腔内表面

对于金属载体，通常采用316L不锈钢材质（符合GB/T 14992）。由于方形金属载体在振敲时容易将玻璃试管撞碎，标准规定金属载体一般制成直径12mm的圆形，厚度0.5mm。

3.2 载体的预处理——脱脂

新载体在使用前必须进行脱脂处理，以去除表面油脂，保证菌液能够均匀附着。标准脱脂程序如下：

1. 将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30分钟

2. 用自来水洗净

3. 用蒸馏水煮沸10分钟

4. 用蒸馏水漂洗至pH呈中性

5. 晾干备用

脱脂后的载体经压力蒸汽灭菌（或160℃干热灭菌2小时）后，方可进行染菌操作。

四、染菌载体的制备——滴染法

染菌载体的制备核心方法是 “滴染法” 。

4.1 菌悬液的制备

将标准菌株的新鲜斜面培养物用稀释液洗脱，制备成菌悬液。以白假丝酵母为例：

• 细菌繁殖体可使用经18～24小时培养的新鲜斜面培养物

• 菌悬液含菌量约为10⁹ CFU/mL，可使用浊度计调整浓度

• 然后加入等量的3.0%或0.3%的牛血清白蛋白（作为有机干扰物），使菌液浓度约为5×10⁸ CFU/mL

牛血清白蛋白的加入是为了模拟实际消毒场景中有机物（如血液、分泌物）对消毒效果的干扰。

4.2 滴染操作

将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，用微量移液器逐片滴加菌液：

• 每片滴加量为10 μL

• 滴加不宜过快，避免菌液流散影响染菌的准确性

• 必要时用接种环将菌液涂匀整个载体表面

4.3 干燥

滴染后的载体需要进行干燥，使菌牢固附着：

• 可置37℃温箱内干燥约20～30分钟

• 或置室温下自然阴干

需特别注意：不同菌种对干燥温度的耐受性不同。研究表明白假丝酵母在37℃干燥会受到较大影响，建议采用室温（约23℃）干燥，即使干燥时间超过60分钟也能保证充足的存活率。

干燥后的染菌载体应放入无菌平皿中，2小时内完成消毒处理。

五、回收菌量的检验与确认

染菌载体最关键的质量指标是每片载体的回收活菌数。标准要求：每个菌片（载体）的回收菌量应为1×10⁶ ～ 5×10⁶ CFU/片。

5.1 检验方法

取制备好的染菌载体（作为阳性对照），按以下步骤进行活菌计数：

1. 将菌片投入含5 mL稀释液的无菌试管中

2. 用电动混匀器混合20秒，或在手掌上用力振打80次，将菌洗脱下来

3. 取洗脱液进行10倍梯度稀释

4. 取合适稀释度的样液涂布平板或倾注平板

5. 培养后计数菌落数，乘以稀释倍数，计算每片载体的实际菌量

5.2 重要原则

《消毒技术规范》特别强调：“用浊度计测定的菌悬液浓度，只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计。作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告，必须以活菌培养计数的实测结果为准，不得使用根据比浊法判定的估计值。”

这一原则确保了染菌载体标注的菌量是真实可靠的，而非估算值。

六、载体定量杀菌试验的操作流程

6.1 试验分组

标准的载体定量杀菌试验需设置以下组别：

• 试验组：染菌载体经消毒剂处理

• 阳性对照组：染菌载体未经消毒剂处理，直接中和培养（用于计算原始菌量）

• 阴性对照组：仅含中和剂和培养基，验证无菌操作

• 中和剂对照组：验证中和剂能有效终止消毒剂作用且对菌无伤害

• 载体对照组：未染菌载体加消毒剂，验证载体无干扰

6.2 消毒与中和

1. 将染菌载体完全浸泡于消毒剂中

2. 在规定的作用时间（如1、5、10分钟）后，用无菌镊子取出载体

3. 迅速放入含5 mL 中和剂的试管中

4. 中和10分钟，充分混匀

中和剂的选择至关重要——必须根据消毒剂的有效成分选择相应的中和剂（如含氯消毒剂用硫代硫酸钠），且需经过中和剂鉴定试验验证，确保中和剂能有效终止消毒剂作用且不影响微生物活性。

6.3 活菌计数与结果计算

按与5.1相同的方法对试验组和阳性对照组进行活菌计数，然后计算 “杀灭对数值”（KL）：

KL=log⁡10(阳性对照组平均菌数)−log⁡10(试验组平均菌数)KL=log10(阳性对照组平均菌数)−log10(试验组平均菌数)

6.4 结果判定

根据消毒剂的类型和应用场景，KL值要求不同：

消毒剂类型	KL值要求	应用场景
灭菌剂	≥ 5.0	手术器械、植入物
高水平消毒剂	≥ 3.0	内镜、呼吸机管路
中水平消毒剂	≥ 2.0	物体表面、环境消毒

七、注意事项与质量控制

7.1 染菌载体的时效性

染菌后的载体应在2小时内完成消毒处理。制备好的菌悬液和菌片应尽量减少在室温下的放置时间，以减少微生物的自然死亡。

7.2 无菌操作

配制菌悬液和制备菌片时，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌影响试验结果。

7.3 初始菌浓度的调整

考虑到干燥过程中部分菌种会死亡，制备菌悬液时应适当提高初始菌浓度。《消毒技术规范》指出，铜绿假单胞菌在37℃干燥过程中滴度可下降1个对数值，此时应提高初始菌浓度以补偿干燥损失。白假丝酵母在室温干燥时存活较好，但也建议适当提高初始菌悬液密度。

7.4 试验重复性

载体定量杀菌试验应重复3次，以确保结果的可靠性。

7.5 生物安全

白假丝酵母（CMCC(F)98001）等标准菌株的生物安全等级为2级，操作应在II级及以上生物安全柜中进行。

八、商品化染菌载体的价值

1. 标准化：每片载体的菌量经活菌计数验证，严格控制在1×10⁶ ～ 5×10⁶ CFU/片范围内

2. 即用性：用户无需自行完成菌悬液制备、载体脱脂灭菌、滴染、干燥等繁琐步骤，开盒即用

3. 可追溯性：菌株来源明确（CMCC标准菌株），符合《消毒技术规范》和GB/T 38502等标准要求

4. 节省时间：商品化产品交付周期短（1～3天），大幅提升检测效率

九、总结

载体定量杀菌试验是连接实验室消毒测试与现场实际消毒效果评价的重要桥梁。相较于悬液定量法，它更真实地模拟了微生物附着于物体表面的自然状态，从而为消毒剂的实际应用效果提供了更具参考价值的科学依据。

从菌种选择到载体处理，从滴染干燥到活菌计数，染菌载体的制备是一项对标准化和操作严谨性要求极高的工作。白假丝酵母之所以被选为代表性菌株，不仅因其作为常见条件致病真菌的临床和环境代表性，更因其在室温干燥条件下具有优良的存活能力——这是保证染菌载体质量的关键生物学前提。同样，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽孢等标准菌株，分别从不同微生物类型和抗力层级，共同构成了消毒效果评价的完整菌种体系。

整个试验流程的核心评价指标——杀灭对数值（KL），以直观的量化方式判定消毒剂是否达到灭菌（KL≥5.0）或高水平消毒（KL≥3.0）等标准，使消毒效果的评价从经验性判断走向科学化、数据化的轨道。

而商品化预制的染菌载体，则将原本繁琐、耗时的载体制备、菌量验证等工序前置于生产环节中，以“即取即用”的形式大幅提升了实验室的检测效率和结果的可比性。这类产品不仅降低了因实验室间操作差异带来的不确定性，也为消毒产品注册检验、医疗机构消毒质量监测以及公共卫生突发事件中的快速评估提供了可靠的标准化工具。

总而言之，规范化的染菌载体制备与应用，既是消毒学基础研究向实际应用转化的技术载体，也是保障医院感染控制、食品安全和公共卫生安全的重要基础支撑。

随着消毒标准体系的不断完善和检测技术的持续进步，未来染菌载体有望在材质多样性（如塑料、陶瓷、涂层表面）、菌种覆盖面（如病毒替代物、耐药菌株）及自动化检测配套等方面实现进一步拓展，为更精准、更高效的消毒评价体系奠定坚实基础。

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