布鲁氏菌琼脂（Brucella Agar）：成分、原理、配制、结果判读与应用综述

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　浏览量：44　　发布时间：2026-06-22 15:53:35

引言

布鲁氏菌属（Brucella）是一类革兰氏阴性、细胞内寄生的球杆菌，是引起人畜共患布鲁氏菌病的病原体。该病在全球范围内流行，尤其在畜牧业发达地区。布鲁氏菌可感染牛、羊、猪、犬等多种动物，导致流产、不育及全身性感染；人类则通过接触感染动物或其产品（如未经消毒的乳制品）感染，表现为波状热、关节炎、心内膜炎等慢性消耗性疾病。由于布鲁氏菌具有极高的营养要求（高度苛养），且生长缓慢，常规培养基难以支持其生长。此外，其传染性极强（感染剂量低至10-100个菌体），操作需在生物安全三级（BSL-3）条件下进行。

布鲁氏菌琼脂（Brucella Agar）是一种专门为分离和培养布鲁氏菌等苛养微生物而设计的营养丰富型培养基。通常以基础琼脂形式供应，使用时需添加5-10%的无菌脱纤维血液（如马血、羊血）以提供生长所需的X因子、V因子及其他营养因子。该培养基也可用于培养弯曲杆菌（Campylobacter）、链球菌、肺炎球菌、李斯特菌等多种苛养菌。本文将对布鲁氏菌琼脂的配方、作用原理、规范制备步骤、结果判读、主要应用及局限性进行全面阐述，并强调生物安全注意事项，以期为临床微生物实验室及相关检测机构提供技术参考。

布鲁氏菌琼脂

图1、布鲁氏菌琼脂

一、培养基成分与配方

1.1 经典配方（布鲁氏菌琼脂基础，每升纯化水）

组分	含量（g/L）	主要作用
酪蛋白酶消化物	10.0	提供氨基酸、多肽等有机氮源
动物组织酶消化物	10.0	补充氮源、维生素及矿物质
酵母浸粉	2.0	提供B族维生素及其他生长因子
氯化钠	5.0	维持渗透压平衡
葡萄糖	1.0	作为碳源和能量来源
亚硫酸氢钠	0.1	还原剂，降低氧化还原电位，保护不耐氧成分
琼脂	15.0	凝固剂
最终pH（25°C）	7.0 ± 0.2	接近中性，适合大多数苛养菌

说明：上述为基础琼脂配方，使用前必须添加无菌血液（通常为5% v/v 马血、羊血或兔血），以提供布鲁氏菌生长所需的血红素（X因子）和NAD（V因子）。未加血的布鲁氏菌琼脂无法支持多数布鲁氏菌的初次分离。

1.2 选择性添加剂（可选，用于污染严重的样本）

若样本（如粪便、环境拭子）中杂菌较多，可在灭菌后冷却至50°C时添加以下抗生素混合物（改良Farrell培养基）：

抗生素	终浓度（mg/L）	作用
放线菌酮（Cycloheximide）	100	抑制真菌
多粘菌素B（Polymyxin B）	10	抑制革兰氏阴性杆菌
杆菌肽（Bacitracin）	25	抑制革兰氏阳性球菌
萘啶酸（Nalidixic acid）	10	抑制肠杆菌科

注意：选择性培养基仅用于疑似布鲁氏菌的分离，不适用于所有样本，且可能抑制部分布鲁氏菌菌株。

二、作用原理

2.1 营养支持

• 酪蛋白酶消化物与动物组织酶消化物：提供丰富的氨基酸、短肽和含氮化合物，满足布鲁氏菌等苛养菌对氮源的严格要求。

• 酵母浸粉：富含B族维生素（硫胺素、核黄素、烟酸、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸等），是许多细菌生长必需的辅酶因子来源。

• 葡萄糖：提供可直接利用的碳源，通过糖酵解和三羧酸循环产生ATP。

• 无菌血液：血液中的血红蛋白提供X因子（血红素），红细胞内含有V因子（NAD），两者对布鲁氏菌、嗜血杆菌等至关重要。此外，血液中的血清蛋白可中和有毒代谢产物，促进细菌生长。

2.2 物理化学条件

• 氯化钠：维持等渗环境，防止细菌因渗透压变化而破裂。

• 亚硫酸氢钠：作为还原剂，降低培养基中的溶解氧和氧化还原电位，创造一个微需氧或厌氧菌更易生长的环境。虽然布鲁氏菌为需氧菌，但初次分离时通常需要5-10% CO₂，还原剂有助于保护细胞免受氧自由基损害。

• pH 7.0：中性环境适合大多数致病菌生长。

2.3 气体环境

大多数布鲁氏菌（特别是羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌）在初次分离时需 5-10% CO₂。因此，接种后的平板应置于含CO₂的培养箱或烛缸中孵育。少数种（如猪布鲁氏菌）可在普通有氧环境中生长。

三、配制与使用方法

3.1 材料准备

• 布鲁氏菌琼脂基础干粉（或各组分：酪蛋白酶消化物、动物组织酶消化物、酵母浸粉、氯化钠、葡萄糖、亚硫酸氢钠、琼脂）

• 蒸馏水或去离子水

• 无菌脱纤维马血、羊血或兔血（4°C保存）

• 1 M NaOH或1 M HCl（用于pH调节）

• 高压灭菌锅

• 生物安全柜（Ⅱ级或以上）

• 无菌培养皿

3.2 配制步骤（以1 L为例）

1. 称量：称取布鲁氏菌琼脂基础干粉43 g（若自行配制则按上述配方称量各组分）。

2. 溶解：将干粉加入约600 mL蒸馏水中，搅拌混合。加热并不断搅拌至完全溶解。避免过度煮沸（煮沸1分钟虽可加速溶解，但可能破坏亚硫酸氢钠和葡萄糖，建议加热至微沸即停止）。

3. pH调节：待溶液冷却至40-50°C，用pH计测定。若偏离7.0±0.2，用1 M NaOH或1 M HCl缓慢调节。

4. 定容：用蒸馏水补足至1000 mL，混匀。

5. 灭菌：分装至适宜容器（三角瓶或培养基瓶），于121°C高压灭菌15分钟。注意：不可过度灭菌，否则会破坏糖类和还原剂。

6. 冷却：灭菌后取出，放置于50°C水浴中冷却至约45-50°C（手背触碰容器稍烫但可耐受）。

7. 添加无菌血液：在生物安全柜中，无菌加入 50-100 mL 无菌脱纤维马血（终浓度5-10%），轻轻混匀（避免产生气泡）。血液应在37°C预热后加入，以防琼脂凝固不均。

8. 倾注平板：将加血后的培养基均匀倾注至无菌培养皿，每皿约15-20 mL，静置凝固。也可分装至试管中制成斜面或高层。

9. 表面干燥：凝固后的平板可在生物安全柜中打开盖约15-30分钟，使表面干燥，便于涂布划线。

10. 储存：加血平板应密封（如使用塑料袋）并倒置于 2-8°C 冰箱中避光保存。有效期为7-14天（血液成分易降解，建议1周内使用）。未加血的基础平板可保存4周。

3.3 接种与培养

• 样本类型：血液（最好用双相培养基或溶解离心法）、骨髓、淋巴结活检、胎盘、流产胎儿胃内容物、乳制品、环境拭子等。

• 划线方法：在生物安全柜中，用无菌接种环取样本或增菌培养物，采用四区划线法涂布于布鲁氏菌琼脂平板表面。

• 培养条件：

o 温度：35 ± 2°C

o 气体：5-10% CO₂（使用CO₂培养箱或烛缸）

o 湿度：保持高湿度（可在培养箱内放置水盘）

o 时间：至少72小时，如无生长应继续孵育至7-10天（布鲁氏菌生长缓慢）。

• 生物安全：所有操作必须在Ⅱ级生物安全柜中进行；穿戴防护服、手套、护目镜；处理后的废弃物必须高压灭菌。

3.4 质量控制

每批新配制的布鲁氏菌琼脂（加血）应进行性能测试：

• 无菌试验：随机取3个平板，于35°C、5% CO₂孵育48小时，应无菌落生长。

• 阳性对照：接种羊布鲁氏菌 Brucella melitensis ATCC 43008（BSL-3，需在相应实验室操作），35°C、5% CO₂培养72小时，应出现细小、透明、光滑、凸起的菌落。

• 阴性对照：接种大肠埃希菌 E. coli ATCC 25922，35°C、5% CO₂培养48小时，应有适量生长（非抑制，证实培养基无选择性）。若需验证选择性，应使用含抗生素的改良配方。

四、结果判读与菌落形态

4.1 培养后观察

孵育72小时后，布鲁氏菌菌落通常较小（直径0.5-1.5 mm），需在良好光线下用放大镜或低倍显微镜观察。不同种的布鲁氏菌在加血布鲁氏菌琼脂上的典型特征如下：

菌种	菌落形态（35°C，5% CO₂，72h）	备注
羊布鲁氏菌 B. melitensis	细小、透明或半透明、圆形、边缘整齐、表面光滑、隆起、有光泽	菌落呈露珠状，直径约0.5-1.0 mm
牛布鲁氏菌 B. abortus	类似羊布鲁氏菌，但菌落稍大（1.0-1.5 mm），有时呈淡灰色	初次分离需CO₂
猪布鲁氏菌 B. suis	菌落稍粗糙，边缘不规则，直径1-2 mm	可在普通空气中生长（无需CO₂）
绵羊布鲁氏菌 B. ovis	细小、半透明、凸起，表面光滑，常呈粘液状	需CO₂，菌落有时呈淡褐色
犬布鲁氏菌 B. canis	灰白色、圆形、光滑，直径0.5-1.5 mm	不产色素，可在空气中生长

4.2 其他苛养菌在布鲁氏菌琼脂上的生长

该培养基也支持多种其他苛养菌的生长（供参考，但不作为主要鉴定依据）：

微生物	生长特征
弯曲杆菌属（如空肠弯曲菌）	灰白色、扁平、湿润、不规则边缘，有时呈蔓延生长（需微需氧环境）
流感嗜血杆菌	需添加X和V因子（血液已提供），菌落细小、透明、露珠状
肺炎链球菌	直径0.5-1.0 mm，α-溶血，中央凹陷（脐窝状）
化脓性链球菌	细小、半透明，β-溶血
单核细胞增生李斯特菌	灰白色、细小、光滑，有狭窄的β-溶血环
脑膜炎奈瑟菌	无色至灰色，光滑，湿润，边缘整齐

注意：在布鲁氏菌琼脂上，金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌不被抑制，同样能生长（金黄色葡萄球菌形成金黄色不透明菌落，大肠杆菌形成灰白色湿润菌落）。这是布鲁氏菌琼脂基础（不加抗生素）的非选择性特征。若需抑制杂菌，应使用添加了抗生素的选择性布鲁氏菌琼脂。

4.3 半定量评分

对于临床标本，可根据各划线区生长情况半定量记录：

• 4+：第一区融合生长，第二区密集，第三区>20个菌落

• 3+：第一区融合生长，第二区>20个菌落

• 2+：第一区融合生长，第二区<20个菌落

• 1+：仅第一区有生长

• 阴：无菌落生长

五、主要用途与应用场景

5.1 布鲁氏菌的分离与培养

• 从临床标本（血液、骨髓、脑脊液、淋巴结穿刺物、胎盘、流产胎儿胃内容物）中分离布鲁氏菌。

• 从动物组织（乳腺、睾丸、子宫分泌物）及环境样本（饲料、土壤）中检测布鲁氏菌。

• 用于布鲁氏菌的传代保存及后续鉴定（如生化试验、PCR）。

5.2 其他苛养菌的培养

• 弯曲杆菌属的分离（需微需氧环境，加血布鲁氏菌琼脂可作为替代培养基）。

• 链球菌、肺炎球菌、李斯特菌的增菌或纯化。

• 嗜血杆菌、奈瑟菌的分离（需补充CO₂）。

5.3 食品与兽医检测

• 美国公共卫生协会（APHA）推荐使用布鲁氏菌琼脂从乳制品（如未经巴氏消毒的奶制品）中分离布鲁氏菌。

• 兽医实验室用于检测动物流产病因。

5.4 溶血反应测定

在添加5%血液的布鲁氏菌琼脂上，可观察细菌的溶血类型（α、β、γ溶血）。

六、局限性

1. 非选择性（基础配方）：不加抗生素的布鲁氏菌琼脂支持多种革兰氏阳性及阴性菌生长，不能抑制杂菌。若样本污染严重，应使用选择性改良培养基（如Farrell培养基）。

2. 初次分离需CO₂：绝大多数布鲁氏菌在初次分离时要求5-10% CO₂环境，普通培养箱无法满足，否则生长不良或失败。

3. 生长缓慢：布鲁氏菌需孵育72小时以上甚至7天才能形成可见菌落，不适用于快速检测。

4. 生物安全风险高：布鲁氏菌传染性极强，必须在BSL-3实验室操作。非专业实验室不应进行活菌培养。

5. 某些菌株营养需求差异：个别布鲁氏菌菌株（如部分牛布鲁氏菌疫苗株）可能在添加血液后仍生长不良，需额外补充血清或特殊生长因子。

6. 不能仅凭形态鉴定：菌落形态不能区分布鲁氏菌种，必须结合氧化酶、尿素酶、H₂S产生、染料抑制试验及分子方法。

7. 血液添加剂不稳定：含血平板储存期短（约1周），且批次间血液质量差异可能影响结果。

七、生物安全特别注意事项

由于布鲁氏菌是潜在的生物武器病原体，被列为BSL-3/ABSL-3病原体，任何涉及活菌的操作必须遵守以下规范：

• 实验室必须通过BSL-3认证，配备独立的负压通风系统和HEPA过滤。

• 所有操作（包括配制、接种、观察）必须在Ⅱ级生物安全柜中进行。

• 操作人员必须穿戴正压防护服或至少双层手套、防护面罩、隔离衣。

• 培养物、平板、移液管等所有接触物必须经121°C高压灭菌30分钟后方可废弃。

• 发生泄漏或暴露，立即报告实验室主管，并按应急预案处理（如暴露后预防性用药）。

• 未经灭活的布鲁氏菌培养物不得移出BSL-3实验室。

八、常见问题与故障排除

问题	可能原因	解决方法
平板无菌落生长	未添加血液；CO₂浓度不足；孵育时间不够；样本中无活菌	确认加血；使用CO₂培养箱；延长孵育至7-10天；阳性对照验证
杂菌过度生长	样本污染严重；未使用选择性培养基	使用含抗生素的布鲁氏菌琼脂；增加样本稀释度
菌落过小不易观察	孵育时间不足；温度偏低；CO₂缺失	继续培养72-96小时；核实温度；检查CO₂供应
平板表面干裂	倾注时培养基过热；储存失水	冷却至45-50°C再倾注；使用密封袋保存
血液凝块或溶血	血液非无菌或反复冻融	使用新鲜无菌脱纤维血；避免冻融

九、结语

布鲁氏菌琼脂（加血）是分离和培养布鲁氏菌及其他苛养微生物的经典培养基。其丰富的氮源、碳源及血液补充物，结合中性pH和适宜的氧化还原电位，能够支持这些生长挑剔的细菌繁茂生长。然而，该培养基的基础配方不具备选择性，因此对污染严重的样本需使用添加抗生素的改良配方。正确使用时，必须严格控制CO₂环境（5-10%），延长孵育时间至72小时以上，并严格遵守BSL-3生物安全规范。

布鲁氏菌病的诊断不能仅依赖培养，还需结合血清学（平板凝集、试管凝集、ELISA）、分子生物学（PCR）及流行病学信息。布鲁氏菌琼脂作为基础分离工具，在兽医公共卫生、食品微生物检测及临床微生物学中仍不可替代。使用者应充分理解其原理与局限，规范操作，确保检测结果的准确性与实验室安全。

参考文献

https://microbenotes.com/brucella-agar/

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