牛瘤球菌属（Ruminococcus bovis sp. nov.），一种从奶牛瘤胃中分离出的新型淀粉溶解瘤球菌

引言

本研究描述了一株分离自奶牛瘤胃内容物的菌株 JE7A12T（=ATCC TSD-225T=NCTC 14479T）。研究探讨了该分离株的表型和基因型特征。结果表明，JE7A12T 是一种严格厌氧、过氧化氢酶阴性、氧化酶阴性且以链状生长的球菌。

API 50 CH 碳源检测试剂盒检测到该菌株能发酵 D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、糖原和淀粉。高效液相色谱（HPLC）分析显示，乙酸是其碳水化合物发酵的主要产物。 基于 16S rRNA 核苷酸序列和全基因组氨基酸序列的系统发育分析表明，JE7A12T 与瘤胃球菌属Ruminococcus）中亲缘关系最近的邻居物种相比，处于一个独立的分歧进化支系。

综合 16S rRNA 序列比对、全基因组平均核苷酸一致性（ANI）以及 DNA G+C 含量的数据分析结果，表明 JE7A12T 代表了一个新物种，我们提议将其命名为牛瘤胃球菌Ruminococcus bovis）， 并将 JE7A12T 作为其模式菌株。

一、分离与生态

1、样本的分离与培养

JE7A12T 是从美国加利福尼亚州图莱里（Tulare）某农场一头健康荷斯坦奶牛的瘤胃内容物中回收得到的。

分离条件为 37°C 厌氧环境（5% H2、20% CO2、75% N2），培养基为改良的含碳水化合物碎肉肉汤固体培养基（DSMZ Medium 110）。

该培养基的改良之处在于：去除了无脂碎肉和酪蛋白，并每升培养基额外添加了 30.0 g 蛋白胨、15.0 g 肉提取物、10.0 g 肉蛋白胨、15.0 g 琼脂以及 100 ml 澄清瘤胃液 。 在 37–39°C 厌氧培养 48 小时后，JE7A12T 在补充了 0.4 g/L 盐酸半胱氨酸、0.02 g/L 柠檬酸铁铵、10 µg/L 维生素K1、2.0 mg/L 刃天青钠盐、10.0 ml/L 维生素补充剂 ATCC MDVS（ATCC）以及 7.0 g/L Gelrite（CP Kelco 公司）的 Bacto 胰蛋白酶大豆肉汤（BD公司）（简称 TSB+FAC）培养基上，呈现出直径约 0.1–0.3 mm 的灰白色菌落。

革兰氏染色按照 Beveridge 描述的方法进行。细胞形态是在 Accu-Scope EXC-350 光学显微镜下观察的，所用细胞在 TSB+FAC 培养基上于 37°C 培养了 48 小时。细胞大小使用 Captavision +（Accu-Scope） 显微成像软件进行测量。细胞革兰氏染色呈阳性，不形成芽孢，呈现为直径 0.9–1.2 µm 的小球菌。

该菌株在有氧环境下无法生长，因此被认为是专性厌氧菌。与该属之前的描述一致，JE7A12T 是一种严格厌氧的球菌， 通常成对或呈链状出现。尽管是从瘤胃内容物中分离出来的，但 JE7A12T 的生长并不依赖瘤胃液。

2、16S rRNA 系统发育分析

基于 16S rRNA 的系统发育树是使用 MEGA X 软件 [25] 通过邻接法（neighbor-joining method）计算构建的。JE7A12T 被置于一个包含梭菌目（Clostridiales）下所有具有全长 16S rRNA 序列的物种模式菌株的系统发育树中，这些序列均获取自 RDP 数据库 [26]。为了便于展示，该树状图经过修剪， 仅保留了瘤胃球菌属（Ruminococcus）当前的所有成员以及亲缘关系相近的邻居物种（图 1）。

图1： JE7A12T 的 16S rRNA 系统发育树状图，由 MEGA X 软件构建。图中展示了 JE7A12T、瘤胃球菌属Ruminococcus）物种的模式菌株以及亲缘关系相近物种的模式菌株。 该树基于 RDP 数据库中梭菌目Clostridiales）成员的 16S rRNA 模式菌株序列，通过比对 1500 nt（核苷酸）序列并采用邻接法（neighbor-joining method）重建而成。 JE7A12T 的节点和标签以绿色字体显示。瘤胃球菌属第 1 类群的模式菌株以蓝色字体显示。各分支节点的数值为经 500 次重复抽样计算得出的 Bootstrap 值（自举支持率）。

3、基因组特征

采用改良的 Sambrook 酚-氯仿提取/纯化方案 ，从 JE7A12T 纯培养物中提取 DNA。使用 Kapa HyperPlus 试剂盒（Roche）构建用于全基因组测序的短读长文库，并在 MiSeq（Illumina）平台上进行单端测序（1×300）。

同时，使用 SQK-RAD004 试剂盒（Oxford Nanopore Technologies）构建长读长文库，并在 MinION 平台（R9.4 流动池）上进行 1D 测序。测序结果使 Illumina 读长的覆盖度大于 100×，Oxford Nanopore 读长的覆盖度达到 55×。

如 George 等人所述，利用 Canu 和 Pilon 软件通过混合组装方法对基因组进行了拼接。组装最终生成了一个长度为 2,440,231 bp 的单环状重叠群（contig），其 N50 值同为 2,440,231 bp。 组装基因组的 DNA G+C 含量为 34.6 mol%。全基因组序列已提交至 NCBI 数据库（登录号 CP039381）。

我们将 JE7A12T 与瘤胃球菌属Ruminococcus）现有的所有成员在基因组大小和 DNA G+C 含量方面进行了比较（表 1）。 JE7A12T 的 DNA G+C 含量为 34.6 mol%，显著低于该属其他任何已知成员的最低值（溶纤维瘤胃球菌R. flavefaciens 和布氏瘤胃球菌R. bromii 菌株的 G+C 含量均为 39 mol% ）， 因此可作为区分该物种的一个鉴别特征。

表1： JE7A12T 与瘤胃球菌属Ruminococcus）成员的生化特征比较；R. champanellensis（尚帕内尔瘤胃球菌）和R. gauvereauii（戈弗罗瘤胃球菌）的发酵数据分别引自 Chassard 等人和 Domingo 等人的研究。所有其他物种的发酵数据均引自 Ezaki。 +, 阳性；−, 阴性；sd, 菌株依赖性（因菌株而异）；w, 弱反应；nd., 无数据；A, 乙酸；F, 甲酸；S, 琥珀酸；*, 基于 NCBI 数据库中所有组装数据的平均值。

为了进一步探究其分类学身份，我们比较了 JE7A12T 与瘤胃球菌属Ruminococcus）现有所有物种的模式菌株之间的全基因组平均核苷酸一致性（ANI）。

此外，由于Clostridium leptum 和Caproiciproducens galactitolivorans 在 16S rRNA 序列上具有较高的相似性， 它们的模式菌株也被纳入了 ANI 分析中。

考虑到 ANI 算法可能存在的偏差，本研究同时利用 MUMmer 和 BLAST 两种算法对 JE7A12T 的 ANI 进行了评估 （见表 2 和表 3）。

结果显示， 没有任何物种达到用于界定物种的 95% 建议阈值。BLAST 算法给出的最佳匹配对象是布氏瘤胃球菌Ruminococcus bromii）。然而，这两个物种在遗传上相距甚远：尽管它们的基因组共享 72.7% 的序列相似性， 但基因组覆盖率仅为 20.1%（表 3）。

与 BLAST 相比，MUMmer 提供了更高的序列相似性匹配结果，所有物种的序列比对值介于 81.7% 至 93.9% 之间。不过，这些匹配的基因组覆盖率非常低（表 2）。 唯一表现出大于 0.3% 基因组覆盖率的物种是布氏瘤胃球菌Ruminococcus bromii）。

综上所述，全基因组核苷酸差异性是区分 JE7A12T 与该属其他类群的有力证据。

表2： 基于 MUMmer 算法的平均核苷酸一致性（ANI）

JE7A12T 与瘤胃球菌属Ruminococcus）物种的模式菌株，以及通过 16S rRNA 序列比对确定的亲缘关系相近物种的模式菌株之间，使用 MUMmer 软件计算得出的平均核苷酸一致性（ANI）。

表3： 基于 BLAST 算法的平均核苷酸一致性（ANI）

JE7A12T 与瘤胃球菌属Ruminococcus）物种的模式菌株，以及通过 16S rRNA 序列比对确定的亲缘关系相近物种的模式种之间，使用 BLAST 软件计算得出的平均核苷酸一致性（ANI）。

4、生理学与化学分类学

JE7A12T 的过氧化氢酶和氧化酶活性分别使用 3% (v/v) 过氧化氢溶液和 1.2% 四甲基对苯二胺二盐酸盐溶液进行测定。生长温度范围在 TSB+FAC 培养基中于 25、30、37、40 和 50 °C 下测定。

观察发现，该菌株在 37 和 40 °C 时生长最佳，在 30 °C 时生长减弱，而在 25 和 50 °C 孵育时不生长。未观察到运动性。

通过在 TSB+FAC 液体培养基中添加不同浓度的 NaCl（从 0.5% 至 4.5%，以 0.5% 递增） 来研究其耐盐生长情况。

将 Hungate 厌氧管在 37 °C 下孵育 72 小时并监测生长情况。结果显示，JE7A12T 能够在高达 2.5% 的盐浓度下生长。通过在 pH 值为 5.0–9.0 的 TSB+FAC 培养基上进行测试， 评估了其对 pH 值的耐受性（以 0.5 个 pH 单位为梯度）。Hungate 厌氧管在 37 °C 下孵育 72 小时并监测生长情况。最适生长 pH 为 7.0–7.5，在 pH 6.0–6.5 时生长减弱；在 pH 8.0–9.0 和 pH 5.0–5.5 的 TSB+FAC 培养基上未观察到生长。

使用 API 50CH 碳源检测试剂盒（BioMérieux）定性测量了 JE7A12T 的碳水化合物发酵能力。将 JE7A12T 细胞培养至对数生长期后期，并在 3000 g 离心力下离心 10 分钟收集细胞。 将细胞重悬后，加入 0.017% (w/v) 的溴甲酚紫作为指示剂，用于指示碳水化合物酸化产酸 [38]。

结果表明，JE7A12T 能发酵 D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、麦芽糖、糖原、七叶苷/柠檬酸铁和淀粉。 未观察到对甘油、赤藓醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、L-木糖、甲基 β-D-吡喃木糖苷、D-纤维二糖、D-阿东醇、D-乳糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-蜜二糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖醇、L-山梨糖、 L-鼠李糖、卫矛醇、肌醇、D-甘露醇、D-山梨醇、甲基 D-吡喃甘露糖苷、甲基 D-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖、苦杏仁苷、熊果苷、松三糖、棉子糖、木糖醇、菊粉、水杨苷、龙胆二糖、松二糖、D-来苏糖、 D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸钾、2-酮葡萄糖酸钾和 5-酮葡萄糖酸钾的发酵作用。

二、结论

牛瘤胃球菌Ruminococcus bovis）是一种专性厌氧、过氧化氢酶阴性且氧化酶阴性的细菌。革兰氏染色呈阳性，在液体培养基中培养时形成小球菌链。在 TSB+FAC 固体培养基上培养时，形成小的、略带不透明的、淡白色、圆形菌落，边缘整齐。

API CH50 检测显示其能发酵 D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、麦芽糖、糖原、七叶苷/柠檬酸铁和淀粉。主要发酵产物是乙酸，乙醇和甘油为次要产物。不产生乳酸、丁酸、丁醇、丙酸、琥珀酸或丙酮酸。

参考文献

1、Sijpesteijn AK. Cellulose-decomposing bacteria from the rumen of cattle. Antonie van Leeuwenhoek. 1949;15:49–52. doi: 10.1007/BF02062631.

2、Sijpesteijn AK. On Ruminococcus flavefaciens, a cellulose-decomposing bacterium from the rumen of sheep and cattle. J Gen Microbiol. 1951;5:869–879. doi: 10.1099/00221287-5-5-869.

3、Ezaki T. Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. 2015.

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更新日期：2026-05-28

编制人：大刘

审稿人：叶凡