硝化球菌属、硫碱弧菌属及硫螺旋菌属生理生态特征、系统分类学及菌种保藏方法

属 IV 硝化球菌属（Nitrococcus）

一、 硝化球菌属（Nitrococcus）细胞形态与生理特性

硝化球菌属（Nitrococcus）细胞呈球形，直径≥1.5 μm，单生或成对存在。

通过二分裂繁殖。胞质内膜呈管状结构，随机分布于细胞质中。

革兰氏染色阴性，借1-2根鞭毛运动。严格好氧，通过氧化亚硝酸盐为硝酸盐获取能量。

专性无机化能自养，最适生长于含亚硝酸盐及其他无机盐的70-100%海水培养基中，无需有机生长因子。分离自海洋环境。

DNA的G+C摩尔百分比为61.2。

模式种：运动硝化球菌（Nitrococcus mobilis）Watson and Waterbury 1971, 224AL

二、 硝化球菌属（Nitrococcus）描述信息

运动硝化球菌，属于γ-变形菌纲 (Gammaproteobacteria) 中的外硫红螺菌科 (Ectothiorhodospiraceae)。

它是硝化细菌中一个独特的例子：在系统发育上，它与同属于γ-变形菌纲的氨氧化细菌（如海洋亚硝化球菌 Nitrosococcus oceani 和“嗜盐亚硝化球菌 Nitrosococcus halophilus”）亲缘关系最近。

所有这些生物都来源于海洋环境，即使在添加了氯化钠的淡水培养基中也无法生长。其生长温度范围为15–30°C，pH值范围为6.8–8.0。

迄今为止，尚未发现来自陆地环境的菌株。其最接近的亲缘属包括外硫红螺菌属 (Ectothiorhodospira)、阿罗蒙纳斯菌属 (Arhodomonas)、嗜盐红螺菌属 (Halorhodospira) 和硫红螺菌属 (Thiorhodospira)。

关于该菌更多生化特性的细节及其与其他亚硝酸盐氧化菌属的比较，请参阅引言章节“锂自养亚硝酸盐氧化细菌”。关于亚硝酸盐氧化菌的生态学和系统发育的详细论述，则收录在引言章节“硝化细菌”中。

由于在Nitrobacter和Nitrococcus这两个属中均发现了发达的内膜系统，Teske等人推测它们可能起源于一个直接的光合作用祖先。

这两个属共同拥有的其他特征还包括a型细胞色素、鞭毛、羧酶体以及储藏性物质。Nitrococcus的管状内膜与Thiocapsa pfennigii (Thiococcus pfennigii) 的内部光合膜系统非常相似。

图1展示了一个带有两根鞭毛的球形Nitrococcus细胞。其管状胞质内膜在图2中清晰可见。细胞在分裂前会变长（大小为1.8 × 3.5 µm），有时会嵌入粘液基质中形成小菌胶团。

其细胞壁结构与大多数其他革兰氏阴性菌相似。管状膜系统源于细胞质膜的内陷，并具有分支特性。

与Nitrobacter类似，其细胞质膜和胞质内膜是不对称的，内侧有一层电子致密层；当细胞破裂并进行负染时，膜的结构便清晰可见。膜表面覆盖着呈行状排列的颗粒（见图2和3）。

Watson和Waterbury曾描述这些直径为6–8 nm的颗粒呈环状，偶尔会排列成直线形。

利用识别Nitrobacter亚硝酸盐氧化还原酶β亚基的单克隆抗体，研究人员用金颗粒对Nitrococcus的颗粒状胞质内膜进行了标记（图4）。

Nitrococcus亚硝酸盐氧化系统的β亚基分子量，与Nitrobacter的β亚基同处于65 KDa范围。

该蛋白质的大小与在Nitrococcus粗提物中发现的主要蛋白质之一（135和61 KDa）相对应。

Nitrococcus细胞内含有a型和c型细胞色素，以及多种内含体，如羧酶体和聚-β-羟基丁酸酯颗粒。此外，还可观察到被认为是糖原组成的电子致密体。

图1.运动硝化球菌的负染细胞，可见鞭毛。比例尺为500 nm。

图2. 运动硝化球菌的超薄切片，显示其管状细胞质内膜，膜表面覆盖有颗粒状结构。比例尺为 250 nm。

图3. 运动硝化球菌分离细胞质内膜的负反差电镜照片。膜表面密布直径约6 nm的颗粒（A），这些颗粒可规则排列成行（B）。比例尺为50 nm。

图4. 通过免疫金标记技术（MAbs 153-1）显示，b型一氧化氮合酶位于运动硝化球菌管状细胞质内膜的细胞质侧。该细胞在包埋处理过程中部分破损。比例尺为 100 nm。

三、 硝化球菌属（Nitrococcus）富集与分离方法

亚硝酸盐氧化菌的分离，可采用成分为表1所示的无机培养基，其中分别列出了用于无机自养、混合营养 与异养生长的培养基配方。

富集培养物需经系列稀释后，于黑暗环境中培养一至数月。

由于亚硝酸盐氧化菌对高的氧分压敏感，其在琼脂表面的生长会受到限制。通过Percoll密度梯度离心，并结合后续的系列稀释法，可将亚硝酸盐氧化菌与异养杂菌分离开来。

表1. 用于亚硝酸盐氧化细菌生长的三种不同培养基：

A培养基（适用于陆地菌株，无机自养型）、B培养基（适用于海洋菌株，无机自养型）、C培养基（混合营养型），以及去除NaNO₂的C培养基（用于异养型生长）

注释：

a 适用于 Bock 等的陆生菌株。

b 根据 Watson 和 Waterbury的研究修改，适用于海洋菌株。

c 适用于 Bock 等的陆生菌株。

d 异养生长培养基 C 不使用 NaNO₂。

e 灭菌后 pH 值应为 7.4–7.8。

四、 硝化球菌属（Nitrococcus）保藏程序

硝化生物在17°C的液体培养基中，能耐受超过一年的饥饿条件。尽管如此，仍建议每四个月将其转接至新鲜培养基中一次。表1列出了三种适用于亚硝酸盐氧化菌的不同生长培养基。

液氮冷冻是一种理想的菌种保藏方法：操作时，需将菌种悬浮于含有蔗糖和组氨酸的冷冻保护缓冲液中，再进行冻存。

五、 硝化球菌属（Nitrococcus）属间鉴别特征

亚硝酸盐氧化菌在形态上具有多样性，包括长杆状、短杆状、球状以及螺旋状菌体。

其中，硝化杆菌属 (Nitrobacter) 与硝化球菌属 (Nitrococcus) 的细胞内，存在着由扁平囊泡或管状结构组成的复杂胞质内膜系统。Nitrococcus 借由1至2根鞭毛进行运动，并具备管状膜系统与羧酶体。

该领域的分类体系奠基自谢尔盖·维诺格拉茨基与海伦·维诺格拉茨基的研究工作。传统的属级分类主要依据细胞形态与胞质内膜的排列方式。

迄今，已描述出四个在形态学上迥异的属（Nitrobacter、Nitrococcus、Nitrospina 与 Nitrospira），共涵盖八个物种。

这四个亚硝酸盐氧化菌属的鉴别特征见表2，其进一步特性见表3，脂肪酸谱图见表4。运动性与羧酶体已在 Nitrobacter 与 Nitrococcus 中观察到（表2与3）。

通过识别其关键酶的单克隆抗体，可将 Nitrococcus 与其他菌属区分开来（表2）。Aamand 等人研发了三种能识别 Nitrobacter 亚硝酸盐氧化还原酶 α 与 β 亚基的单克隆抗体。其中，MAb Hyb 153-2 对 Nitrobacter 的 α-NOR 具有特异性，而 MAb Hyb 153-1 则能同时识别 Nitrobacter 与 Nitrococcus 的 β-NOS。MAb Hyb 153-3 更能识别 Nitrobacter、Nitrococcus、Nitrospina 及 Nitrospira 的 β-NOS。因此，利用这套单克隆抗体，可实现对所有已知亚硝酸盐氧化菌的检测，并能将 Nitrobacter 和 Nitrococcus 与 Nitrospina 和 Nitrospira 区分开来。

表2. 四个属的亚硝酸盐氧化细菌的鉴别特征

注释：

a 岩石自养生长。

b MAb，单克隆抗体。

表3. 亚硝酸盐氧化细菌的特性

表4.已描述的亚硝酸盐氧化细菌物种的主要脂肪酸^a,b

注释：

a 符号说明：+，≤5%；+ +，6–15%；+ + +，16–60%；+ + + +，>60%。

b 摇床培养物在28℃下自养生长（Nitrospira moscoviensis为37℃），并在指数生长期结束时收集。数据修改自Lipski等。

六、 硝化球菌属（Nitrococcus）分类学评述

将 Nitrococcus 划分为一个独立的亚硝酸盐氧化菌属，主要依据是其独特的形态与超微结构。16S rRNA 序列分析结果进一步证实了这一分类地位的独立性。

七、硝化球菌属（Nitrococcus）物种列表

1. 运动硝化球菌（Nitrococcus mobilis）

词源：L. adj. mobilis 可移动的、运动的。

该菌的形态、培养和生化特性与属的描述一致。最短代时为10小时。最适生长温度范围25–30℃，最适pH范围7.5–8.0。模式菌株分离自赤道太平洋海水。

DNA的G+C摩尔百分比为：61.3 (Bd)。

模式菌株：ATCC 25380。

属 V 硫碱弧菌属（Thioalkalivibrio）

一、硫碱弧菌属（Thioalkalivibrio）细胞形态与生理特性

细胞为能运动的革兰氏阴性弯曲杆菌或螺旋菌（0.4–0.6 × 0.8–3.0 μm），具单根极生鞭毛。

细胞壁呈波纹状，含有羧酶体（carboxysomes）。专性化能无机自养菌，能氧化硫化物、硫代硫酸盐、单质硫和连四硫酸盐。

通过卡尔文循环同化碳源。耐盐度达1.2–1.5 M Na⁺，生长至少需要0.3 M Na⁺。

DNA的G+C摩尔百分比为：61–65.6。

模式种：多能硫碱弧菌（Thioalkalivibrio versutus）Sorokin等 2001a, 579

二、硫碱弧菌属（Thioalkalivibrio）进一步描述信息

该类微生物发现于碱性湖泊的水体和沉积物中。实验室研究采用含硫代硫酸盐、硫化物、多硫化物、单质硫和连多硫酸盐的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲培养基。

所有菌株在分批培养的指数期初期能从硫代硫酸盐产生单质硫，该硫在生长后期消失。最适pH为9–10。

能以氨、亚硝酸盐和硝酸盐作为氮源。部分菌株在低氧条件下可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

反硝化硫碱弧菌（T. denitrificans）的模式菌株ALJD为兼性厌氧菌，能分别以硫代硫酸盐和一氧化二氮作为电子供体和受体生长。

基于16S rDNA序列分析，硫碱弧菌属属于γ-变形菌纲，其最近亲缘类群为外硫红螺菌属的两个物种。

三、硫碱弧菌属（Thioalkalivibrio）富集与分离程序

通过好氧富集分离法，使用含硫代硫酸盐的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液基培养基获得该类细菌。对于某些菌株需提高基础培养基中的NaCl浓度。

添加20 mM硝酸盐可获得还原硝酸盐的菌株。唯一反硝化菌株通过硫代硫酸盐和N₂O的厌氧富集培养获得。

四、硫碱弧菌属（Thioalkalivibrio）保藏程序

菌种可在含5 mM MgCl₂（用于稳定细胞壁）的液体盐培养基（pH 10）中于4℃保存2个月（需定期转接），也可在10%甘油中于-80℃保存。

五、硫碱弧菌属物种列表

1. 多能硫碱弧菌（Thioalkalivibrio versutus）

词源：L. adj. versutus 多能的、易变的。

属描述基础上补充：最适生长于大气氧浓度下。

DNA的G+C摩尔百分比为：63–65.6 (Tm)

模式菌株：AL 2, DSM 13738

GenBank登录号（16S rRNA）：AF126546

2. 反硝化硫碱弧菌（Thioalkalivibrio denitrificans）

词源：M.L. v. denitrifico 反硝化；M.L. part. adj. denitrificans 反硝化的。

属描述基础上补充：兼性厌氧反硝化菌。在厌氧条件下以硫代硫酸盐和一氧化二氮为底物时生长最佳。

DNA的G+C摩尔百分比为：62.3–65.0 (Tm)

模式菌株：ALJD, DSM 13742

GenBank登录号（16S rRNA）：AF126545

3. 硝酸盐硫碱弧菌（Thioalkalivibrio nitratis）

词源：M.L. adj. nitratis 硝酸盐的。

属描述基础上补充：在微好氧条件下可将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

DNA的G+C摩尔百分比为：61.3–62.1 (Tm)

模式菌株：ALJ 12, DSM 13741

GenBank登录号（16S rRNA）：AF126547

六、其他相关微生物

Sorokin等人报道了另外两种嗜碱化能自养菌，其16S rDNA序列与硫碱弧菌属（Thioalkalivibrio）物种相关：其中一类能以硫代硫酸盐（thiosulfate） 作为电子供体，同时将硫氰酸盐（thiocyanate） 作为氮源利用；另一类则能将硫氰酸盐同时作为氮源和电子供体利用。

属 VI 硫螺旋菌属（Thiorhodospira）

一、硫螺旋菌属（Thiorhodospira）细胞形态与生理特性

细胞呈弧菌状或螺旋状，借极生鞭毛丛运动，通过二分裂繁殖。革兰氏染色阴性，属于γ-变形菌纲。

其内部光合膜为平行片层结构，纵向贯穿细胞质或位于细胞质膜下方。光合色素包括细菌叶绿素a和类胡萝卜素。

专性光能营养且严格厌氧。在以硫化物为电子供体的光能无机自养生长过程中，单质硫球形成于细胞质外、培养基中、附着于细胞或位于周质空间。

最终氧化产物为硫酸盐。存在硫化物时，可光同化有机物质。生长依赖于低浓度钠盐和碱性条件。

生境：富含有机物的沉积物表层及含硫化物的微咸水苏打湖中的微生物垫。

DNA的G+C摩尔百分比为：56.0–57.4 (Tm)。

模式种：西伯利亚硫螺旋菌（Thiorhodospira sibirica）Bryantseva等 1999b, 700。

二、硫螺旋菌属（Thiorhodospira）富集与分离程序

硫螺旋菌属物种可在光能自养条件下进行选择性富集，其电子供体为硫化物，所用培养基的盐度和碱度应与用于外硫红螺菌属和卤螺菌属的培养基相似。

从合适的环境样本中，无需预先富集，即可通过使用基础培养基（表5）、接种自然样本的琼脂稀释系列法实现分离。培养物在50 ml螺口瓶中进行光能生长，培养温度为25–30℃，光照强度为2000 lux。

表5.基础培养基（g/L蒸馏水）

三、硫螺旋菌属（Thiorhodospira）保藏程序

推荐将液氮保存作为长期保藏的标准程序。具体方法为：在生长良好的培养物细胞悬液中加入二甲基亚砜（DMSO） 至终浓度5%，分装于塑料安瓿管，密封后于液氮温度下冷冻保存。

四、硫螺旋菌属（Thiorhodospira）与其他属的鉴别

硫螺旋菌属物种可通过在光学显微镜下观察到的细胞内外均有单质硫沉积，与其他紫色硫细菌区分。

与外硫红螺菌属和卤螺菌属的鉴别依据包括：硫在细胞内外均有沉积、光合膜堆叠排列不规则、G+C摩尔百分比低值以及16S rDNA序列的某些特征性差异。

其16S rDNA序列与外硫红螺菌属物种的相似度为88–92%。对碳源、硫源和氮源的利用等代谢特性与外硫红螺菌科其他成员高度相似。

硫螺旋菌属物种在0.5–8%的盐浓度范围内生长，此特性与外硫红螺菌属相同。

五、硫螺旋菌属（Thiorhodospira）物种列表

1. 西伯利亚硫螺旋菌（Thiorhodospira sibirica）

词源：M.L. fem. n. sibirica 与西伯利亚相关的或属于西伯利亚的。

细胞弧菌状或螺旋状，3–4 × 7–20 μm，通过形成隔膜进行二分裂繁殖。借极生鞭毛丛运动，鞭毛丛长度与细胞长度近似。

内部光合膜为平行片层结构，纵向贯穿细胞质或位于细胞质膜下方。细胞悬液呈棕红色至红色。

完整细胞悬液在377、485、509、537-550、591、711、799、830、858和901 nm处有吸收峰。光合色素为细菌叶绿素a和螺旋菌素系列的类胡萝卜素，主要组分为脱水玫红弧菌素、玫红品和螺旋菌素。

严格厌氧，专性光能营养。能以硫化物和单质硫作为电子供体进行光能无机自养生长。不氧化硫代硫酸盐。

存在硫化物和碳酸盐时，可光同化乙酸盐、丙酮酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、丙酸盐和富马酸盐。

属中温嗜碱微咸水细菌，最适生长pH 9.0–9.5（范围7.5–10.5），最适温度25–30℃。生长需要碳酸钠和/或氯化钠，盐度范围为0.5–8%碳酸氢钠或0–6%氯化钠（存在0.5%碳酸钠时）。

生境：Malye Kasytui湖沉积物的含硫化物表层。

DNA的G+C摩尔百分比为：56.0–57.4 (Tm)。

模式菌株：A12, ATCC 700588, BN 9312。

GenBank登录号（16S rRNA）：AJ006530。

参考文献

1.Watson, S.W. and J.B. Waterbury. 1971. Characteristics of two marine nitrite oxidizing bacteria, Nitrospina gracilis nov. gen. nov. sp. And Nitrococcus mobilis nov. gen. nov. sp. Arch. Microbiol. 77: 203–230.

2.Watson, S.W., E. Bock, H. Harms, H.P. Koops and A.B. Hooper. 1989.Nitrifying bacteria. In Staley, Bryant, Pfennig and Holt (Editors), Bergey’ s Manual of Systematic Bacteriology, 1st Ed., Vol. 3, The Williams & Wilkins Co., Baltimore. pp. 1808–1833.

# 翻译自：Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Garrity, Berner, Creig) . Volume Two：The Proteobacteria Part B The Gammaproteobacteria.（Order I. Chromatiales）

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更新日期：2025-12-04

编制人：思琪

审稿人：小藻