真菌能活50年吗？俄罗斯真菌保藏中心（VKM）告诉你怎么保藏

引言

这篇文章系统介绍了俄罗斯全俄微生物保藏中心（VKM）在丝状真菌长期保藏方面的实践经验、技术方法、存活数据及操作规程，具有极强的科学性、实用性和指导意义。

尤其对微生物菌种保藏实践和构建微生物保藏中心的具有重要的指导价值

介绍

微生物是科学与应用研究的基础材料。菌种保藏中心（生物资源中心）承担着稳定保存和长期存储微生物资源的核心职能，确保在菌株分离多年后，科研人员或生物技术领域仍能定期获取具有完整记录的标准菌株。

目前已有多种真菌培养物保藏方法见诸报道。冷冻干燥（lyophilization）和低温冷冻保存技术已被全球微生物保藏机构广泛应用于数以千计真菌菌株的保存。

然而值得注意的是，不同真菌物种在实验室长期存储后的存活能力存在显著差异。

有些菌株极难通过异地保存（ex situ）方式维持活力，而另一些菌株几乎可通过任何保藏技术实现高效存活。

丝状真菌的保存策略取决于其产孢类型与程度。产孢菌株（相对于不产孢菌株）可采用冷冻干燥法有效保存。两类菌株均能通过液氮冷冻或超低温冰箱实现长期存储。长期保藏经验表明，真菌菌株的保存时长不仅取决于方法选择，还与实验操作方案及保存温度密切相关。

本章系统介绍了VKM真菌保藏中心，采用的四种保存技术：

低温冷冻保存、冷冻干燥、硅胶干燥及无菌土壤保藏，并附有记录的最长保存时间数据。这些方法综合考虑了菌株特性与设备条件的适配性。

VKM真菌保藏中心（全俄微生物保藏中心，俄罗斯）成立于1955年，在真菌培养物保存领域拥有深厚积淀。目前该中心收藏的丝状真菌约7000株（涵盖590属1600种），包括色素界（Oomycota）和真菌界（接合菌、子囊菌及担子菌）物种。

所有VKM真菌菌株的保藏信息均存储于MS Access数据库，详细记录菌株编号、保藏日期、各方法检测时间及其他技术参数。通过专门设计的查询程序「FunPreservEnd」、「FunPreserv_Times」、「FunPreserv_MaxTimes」进行运营数据分析，系统自动计算最长保藏时间。

历经多年保藏的不同类群真菌仍保持产生活性物质的能力，为工业和医药领域提供重要原料。例如接合菌纲的日本 Cunninghamella japonica VKM F-1204D 被证实是生物柴油生产的潜在油脂来源；青霉属（Penicillium）菌株VKM F-325、VKM F-691和VKM F-1823在保藏40余年后仍能合成多种结构多样的活性化合物；52年前收储的巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）VKM F-1119至今仍参与青蒿素（治疗热带疟疾的关键药物）的生物转化过程。最新研究表明，经过冷冻干燥与长期保存的黑曲霉组（Aspergillus section Nigri）菌株仍能保持其生物技术潜力。

丝状真菌的低温冷冻保存

研究表明，采用快速冷却后置于-196℃液氮中保存的方式，可实现部分真菌培养物的长期稳定存储。然而不同属/种真菌的抗冻耐温能力存在显著差异，这取决于其固有特性（产孢能力及孢子类型、细胞膜化学组成、细胞壁结构、生理状态等）。通过优化冷冻保护剂配方、冷却速率及复温程序，目前已成功扩展了该方法适用的真菌类群范围。

VKM收藏的丝状真菌中超过75%采用不同冷冻方案保存。具有发达有性/无性孢子的菌株通常采用快速冷冻后液氮保存或-70℃超低温冰箱保存。

研究发现，即使某些具丰富孢子的接合菌（如被孢霉属、蛙粪霉属、Coemansia属、虫霉属）也无法承受超快速冷冻过程。通过调整冷冻方案（如采用程序化慢速冷冻）成功实现了这类菌株的保存。该优化方案同样适用于不产孢真菌（担子菌）及产生游动孢子的卵菌（色素界，卵菌门）。

数据显示，部分卵菌门（20%）、担子菌（4%）、接合菌（1%）和子囊菌（1%）菌株在所有冷冻方案调整后仍无法存活。

最难保存的菌株属于网囊霉属（Dictyuchus）和疫霉属（Phytophthora），以及部分绵霉属（Achlya）和水霉属（Saprolegnia）物种。某些担子菌（如乳牛肝菌属、鹅膏属、竹荪属、Mutinus属等）也呈现类似情况，这类菌株通常需通过定期传代和矿物油覆盖法进行保藏。

虽有观点认为能耐受冷冻及短期存储的微生物培养物可永久保持活力，但我们的数据表明该结论并不完全准确：

部分彩色绵霉（Achlya colorata）、错综绵霉（Achlya intricata）、香杯伞（Clitocybe odora）、联合笄霉（Choanephora conjuncta）、血栓状锥孢霉（Conidiobolus thromboides）、Kickxella alabastrina、血红显毛革菌（Phanerochaete sanguinea）、 Rhodocollybia butyracea 及土生水霉（Saprolegnia terrestris）菌株，在液氮保存5-7年后失去生长能力，尽管其在保存24小时后仍显示活性，具体原因尚未明确。尽管如此，存活率测试表明311种真菌代表株在保存20-30年后仍保持活力。

VKM目前使用的冷冻设备包括，容量500升的"Bioproducts-0.5"液氮储罐及-80℃超低温冰箱（日本三洋制造）。

丝状真菌的冷冻干燥保藏

目前VKM约85%的丝状真菌采用冷冻干燥法保存。能形成休眠结构（孢子、菌核等）的不同分类群真菌（接合菌、有性型与无性型子囊菌）通常可耐受此过程。

数据显示，这些真菌类群中约90%的菌株通过该方法保持活性。我们发现817种真菌的冻干菌株在5℃下保存20年以上仍具活力，其中289种甚至成功保存了40至50年。

但部分菌株即使产孢丰富也无法存活，如冠状锥孢霉、血栓状锥孢霉、Thaxter虫霉、圆锥虫霉、Dipterigena虫霉、同宗配合小克银汉霉及泡囊小克银汉霉。仅形成菌核作为休眠结构的葡萄孢属物种（蚕豆葡萄孢和鳞片葡萄孢）冻干后存活时间较短，通常不足10年。

由于无菌菌丝体一般难以存活，VKM不对卵菌和不产孢担子菌采用冷冻干燥法保存。目前使用的设备为英国爱德华兹生产的Micromodulyo离心式冷冻干燥机。

丝状真菌的无菌土壤干燥保藏

这一简便通用的真菌保藏方法早在20世纪初就已应用。曲霉属和青霉属物种通过此法保藏的效果优于其他微型真菌。

根据T.P. Suprun对78个青霉物种（超1000株）进行7-10年土壤保藏的研究显示，不对称组菌株保存效果最佳，双轮对称组次之，单轮组效果最不理想。

该方法对保持某些动植病原菌的致病力同样有效。例如日本链格孢（萝卜链格孢同义种）、尖镰孢及壳针孢属物种（燕麦壳针孢、麦类壳针孢、Passerini壳针孢、小麦壳针孢）在保存2-5年后仍能侵染宿主植物。部分退化菌株经土壤保藏后甚至能恢复部分丧失特性。

据我们观察，采用此法保存的167种真菌菌株可维持活性超过30年，其中87种更实现了40至55年的超长期保存。

丝状真菌在硅胶上的干燥保藏

通常，经过固定的微生物细胞在面对各种胁迫时，其活力和生物活性的保持能力优于游离细胞。因此，将细胞预先干燥在吸附剂上，能使微生物在更长时间内保持活力。最常用的吸附剂是硅胶（一种具有大量孔隙的干燥多硅酸凝胶），微生物悬液被接种到硅胶上进行后续干燥。硅胶能促进微生物脱水，并帮助它们耐受热胁迫。由于硅胶可以抑制真菌的所有生长和代谢，因此能够最大限度地降低发生形态、生理和遗传变化的风险。

D. Perkins 于 1962 年提出了使用无水硅胶颗粒来保藏粗糙脉孢菌的储备菌种。多年实践证明，这种新方法持续有效且可靠。

目前，该方法已广泛应用于不同分类群和生态类型的真菌。例如，该方法能有效保藏虫草目昆虫病原真菌长达 2 年，特别是金龟子绿僵菌；也适用于许多其他类群的真菌，包括不能琼脂培养基上生长的专性活体营养寄生菌 Podosphaera fusca 的孢子和锈菌。

研究人员指出，硅胶保藏法的一个缺点是保藏时间相对较短（在 2 到 4 年之间）。但显然，具体操作方案的细节对此法的保藏效果至关重要，其中冷冻保藏的温度直接影响着真菌能保持活力的时间长短。

全俄微生物保藏中心于 20 世纪 80 年代中期引入了硅胶保藏法。我们的经验表明，通过此法保藏的多类群真菌可在多年后仍不失活（见表 1.1）。

表1.1 VKM真菌菌种在硅胶上的干燥处理（保存时间）

我们对超过 300 株具有不同产孢结构的接合菌（涉及 6 纲、6 目、15 科、35 属、118 种）以及近 300 株具有不同分生孢子发生类型的暗色丝状无性型子囊菌（涉及 7 纲、18 目、34 科、79 属、164 种）（表 1.2）进行了活力评估，这些菌株的保藏时间从 1 年到近 30 年不等（图 1.1 和 1.2）。

图1.1 接合菌类真菌在不同温度下于硅胶上的长期保存效果

图1.2 子囊菌类真菌在不同温度下于硅胶上的长期保存效果

结果分析表明，该方法对于大多数受试真菌在 3-7 年内的保藏非常成功（表 1.2）。

表1.2 VKM不同类群真菌在硅胶上长期保存（30年）后于不同温度下的存活率（%）

若只需保藏并定期（每隔 1-2 年）复壮菌种，5°C 的温度完全适用。在此温度下保藏后，超过 97% 的受试接合菌和 94% 的子囊菌仍保持活力。然而，对于长期（超过 10 年）保藏，此温度并不可靠，因为两组真菌的活力分别会降至 57% 和 55%。

-12°C 的温度最不利于长期保藏。在此温度下保藏 10 年后，仅 60% 的接合菌和 35% 的子囊菌存活。保藏 17-20 年后，存活率分别降至 10-13% 和 4%（图 1.1）。在接合菌中，被孢霉纲、虫霉纲和梳霉纲的代表菌株在这些温度下活力丧失最快。保藏 17 年后，其存活率降至 0-4%。相反，耐冷物种 Helicostylum elegans 和 Thamnostylum piriforme 以及耐热物种 Rhizomucor pusillus 的菌株则保持稳定。在暗色丝状无性型子囊菌中，在 -12°C 下保藏 20 年后，Acrophialophora、Alternaria、Coniothyrium、Gonytrichum、Hormoconis、Paraconiothyrium 和 Phialophora 等属的菌株表现出最佳活力。保藏 30 年后，仅剩 1 株菌（Hormoconis resinae）存活。

对于丝状真菌而言，最适宜的保藏温度是 -70°C。在此条件下保藏 30 年后，90% 的菌株仍保持活力（图 1.1）。

采用硅胶在不同温度下保藏丝状真菌的优势显而易见。一方面，该方法非常简单，以至于在设备条件相对简陋的实验室中大多也能进行 5°C 和 -12°C 的保藏。另一方面，若配备超低温冰箱（-70°C），则可以在小空间内保藏大量菌种。此方法的其他优点还包括：准备工作极少，只需将几粒硅胶颗粒转移到合适的培养基上即可快速复活保藏物，以及同一保藏管可在未解冻状态下长期多次使用。

全俄微生物保藏中心使用的制冷设备是超低温冰箱（-70–80°C，日本三洋）和家用冰箱（5°C 和 -12°C）。

硅胶干燥保藏方案

1 无菌硅胶与安瓿瓶的准备

• 将硅胶预先干燥，并于160°C下干热灭菌3小时，并严格监控无菌状态。

• 给塑料保藏管（Nunc）（每株菌种3管）贴上标签，并于121°C下高压蒸汽灭菌20分钟。

• 将已用氯化钴溶液处理过的无菌硅胶放入安瓿瓶中，用于指示湿度。氯化钴在干燥时呈深蓝色，受潮后变为粉色。

• 在指示剂硅胶的上方放置一个无菌棉球。

2 冷冻保护剂的配制：10% (v/v) 甘油

• 向12 mL玻璃试管中加入5 mL 10%的甘油溶液。

• 于121°C高压蒸汽灭菌20分钟。

• 在+5°C下保存，时间不超过一个月。

3 菌种培养物的准备

• 将产孢真菌在最佳生长条件下，接种于斜面琼脂培养基上（适用培养基信息可参考 www.vkm.ru）。

• 用5 mL冰浴过的无菌10%甘油将孢子从琼脂表面冲洗下来。

• 孢子悬液的滴度应不低于 10⁶ 个孢子/mL。

4 硅胶接种

• 在无菌培养皿中加入75-100颗硅胶颗粒（40目，9-16号筛）。

• 向无菌干燥的硅胶颗粒中加入1 mL孢子悬液。

• 晃动培养皿，使孢子悬液与硅胶颗粒充分接触。

• 将培养皿放入干燥器中，并于4–7°C的冰箱内放置12小时。

5 分装保藏管

• 用无菌药匙将吸附有真菌孢子的硅胶颗粒（20-25颗）分别装入3个塑料保藏管中。

• 将保藏管放入盒内，随后分别转移至5°C、-12°C的冰箱以及-70°C的超低温冰箱中保存。

6 活力检测

• 将待检测的保藏管放入特制的金属容器内，该容器内部由膨胀聚苯乙烯恒温，以防止解冻。

• 从保藏管中取出一粒硅胶颗粒，转移到新鲜、适宜的琼脂培养基上，在最佳条件下培养。

• 剩余的硅胶颗粒重新密封后，按原条件继续保藏。因此，每支吸附有真菌孢子的硅胶保藏管均可多次使用。

7 结果

表1展示了VKM实际评估得到的保藏时间数据。这些并非最终数据，因为相关菌株仍在持续保藏中，我们预期未来能获得更长的保藏时间记录。表格中的部分单元格为空，这表示该菌株未采用此法保藏。

目前可以明确的是，采用冷冻保藏法的真菌菌种，超过98%在保藏20年后仍保持活力。对于冷冻干燥法和无菌土壤保藏法，保藏30年后的存活率分别为95%和85%。对于硅胶长期保藏丝状真菌，应选择-70°C的温度条件。在此温度下，超过90%的产孢真菌在实验进行30年后仍能保持活力。

内容总结

1. 保藏目标与重要性

• 微生物菌种是科研与生物技术的基础资源，保藏中心需确保菌株长期稳定、可追溯、可复现。

• 保藏不仅为分类研究，更为工业（如生物柴油）、医药（如青蒿素转化）提供持续生物资源。

2. 主要保藏方法及适用性评估

3. 关键发现与经验

• 温度是决定性因素：

尤其是硅胶法，-70℃保存30年存活率90%，而-12℃保存20年仅剩4–13%。

• 菌株特性决定方法选择：

o 产孢能力强 → 优先冷冻干燥或硅胶法；

o 不产孢或特殊类群（如卵菌、某些担子菌）→ 低温冷冻或矿物油定期传代；

o 植物病原菌 → 无菌土壤法可保持致病性。

• 部分菌株“难保藏”：如网囊霉属、疫霉属、部分虫霉、鹅膏属等，需个性化方案或替代方法。

• 长期保藏≠永久存活：即使初期存活，部分菌株在5–7年后失活（如某些绵霉、伞菌），机制尚不明确。

• 数据库与信息化管理：管理菌株保藏数据，实现动态追踪与最长保存时间计算。

4. 标准化操作流程（以硅胶法为例）

• 硅胶灭菌、指示剂（氯化钴）监控湿度；

• 10%甘油为冷冻保护剂；

• 孢子悬液浓度 ≥10⁶/mL；

• 低温干燥12小时后分装；

• 多温度梯度保存（5℃、-12℃、-70℃）；

• 活力检测时不解冻整管，可多次取用。

菌种保藏实践意义

1. “没有万能方法，只有最优匹配”

• 必须根据菌株分类地位、产孢能力、生理特性选择保藏方法。

• 对难保藏类群（如卵菌、部分担子菌），需尝试多种方案或组合策略（如慢速冷冻+特殊保护剂）。

2. 温度控制是生命线

• 尤其对于干燥法（硅胶、冻干），-70℃是长期保藏的黄金标准。

• -12℃或5℃仅适用于短期或临时保存，不可依赖。

3. 标准化与可重复性至关重要

• 从培养基选择、孢子浓度、保护剂配比，到干燥时间，每一步都需标准化。

• VKM提供的硅胶法SOP极具参考价值，可直接借鉴或本地化改良。

4. 活力监测与数据记录不可忽视

• 定期抽检存活率（如每5–10年）；

• 建立电子数据库，记录保藏日期、方法、检测结果、最长存活时间；

• “FunPreserv”系列查询工具值得借鉴，实现数据自动化分析。

5. “多次取用”设计提升资源利用率

• 硅胶法“不解冻取粒”设计，避免反复冻融损伤，延长保藏管寿命，降低污染风险。

构建微生物保藏中心意义

1. 基础设施规划

• 必须配备超低温设备：-80℃冰箱、液氮罐是长期保藏的核心硬件。

• 干燥设备：冷冻干燥机（优选离心式）、真空干燥器。

• 备份与冗余：重要菌株应在不同方法、不同设备中备份保存。

2. 方法体系构建

• 建立多方法并行的保藏体系，不依赖单一技术。

• 针对不同类群制定保藏策略矩阵（如：产孢子囊菌→冻干；不产孢伞菌→液氮+矿物油）。

• 对“难保藏菌”设立特殊保藏项目，持续优化方案。

3. 信息化与标准化管理

• 建立菌株信息数据库，包含分类、来源、保藏方法、检测记录、应用潜力等。

• 开发或引入保藏管理软件，支持存活率统计、到期提醒、最长保存时间计算。

• 数据应在线可查（如VKM网站），促进资源共享与科研合作。

4. 质量控制与持续评估

• 建立定期活力检测制度（非仅保藏时检测）；

• 对长期保藏菌株进行功能验证（如产酶、产抗生素、致病性等），确保“活且有用”；

• 公布存活率统计数据，增强用户信任与中心权威性。

5. 人员培训与SOP文档化

• 所有操作必须标准化、文档化、可视化（如VKM的1.7节）；

• 新员工需经严格培训，确保操作一致性；

• 建立操作失误记录与改进机制。

6. 面向应用的价值挖掘

• 保藏不仅是“存起来”，更要“用起来”：文中强调保藏菌株仍具工业/医药价值（如青霉产抗生素、曲霉转化青蒿素）。

• 保藏中心应主动与产业界对接，推动菌种资源转化。

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更新日期：2025-09-26

编制人：小灰

审稿人：小藻