动物源空肠弯曲菌检测方法

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　浏览量：298　　发布时间：2024-11-27 10:48:17

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中华人民共和国农业农村部提出。

本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口

本文件起草单位:扬州大学、中国动物卫生与流行病学中心。

本文件主要起草人:焦新安、黄金林、唐苑悦、王娟、任方哲、李凤鸣、曲志娜、宋召军、赵思俊、张纯萍。

动物源空肠弯曲菌检测方法

1范围

本文件描述了动物源空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)多重PCR的检测方法。

本文件适用于畜禽养殖和屠宰过程中动物源空肠弯曲菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB4789.9-2014食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验

NY/T1948医实验室生物安全要求通则

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CFU:菌落形成单位(Colony-forming unit)

DMSO:二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide)

DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)

EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)

mCCDA:弯曲菌选择性琼脂( Modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar)

MHA: Mueller Hinton 琼胎(Mueller Hinton agar)PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline)

PCR:聚会酶链式反厂(Polymerase chain reaction)

TBE:Tris-硼酸盐-EDTA(Tris-Borate-EDTA)

5 设备和材料

5.1冰箱:冷藏温度为2℃~8℃

5.2恒温培养箱:37℃±1℃、42℃±1℃

5.3高压灭菌锅:灭菌温度为121℃,工作压力为0.1 MPa。

5.4恒温振荡培养箱:180r/min、42℃士1℃

5.5微需氧培养装置:5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气

5.6 无菌棉签。

5.7无菌采样袋:12cmx18cm、45cmx55 cm。

5.8无菌采样瓶:1L、50mL。

5.9无菌采样管:5mL、50mL。

5.10 运输蛋托。

5.11无菌剪刀。

5.12无菌镊子

5.13 无菌平皿。

5.14无菌接种环:1 μL。

5.15均质器与配套均质袋

5.16电子天平。

5.17过滤装置及滤膜(0.22μm)

5.18无菌滤纸。

5.19离心机:转速>12000r/min。

5.201.5 ml离心管。

5.21空肠弯曲菌标准株NCTC11351

5.22干式恒温金属浴。

5.23基因扩增仪。

5.24PCR 管

5.25点样梳

5.26制胶槽

5.27凝胶成像仪

6 培养基与试剂

6.1mCCDA:见附录A中A.1.

6.2MHA血平板:见A.2

6.3Bolton 肉汤:见A.3。

6.4Cary-Blair运输培养基:见A.4。

6.5多重PCR反应体系:见A.5.

6.6PBS:见 A.6.

6.70.1%蛋白胨水:见A.7.

6.8灭菌超纯水。

6.9 0.5xTBE电泳缓冲液:见A.8

6.101.2%琼脂糖凝胶:见A.9。

6.11核酸染料。

6.12介于100bp~2000bp的DNA分子量标准，

6.1310XDNA凝胶加样缓冲液

7生物安全要求

采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作,应遵守NY/T1948的有关规定

8 检验程序

空肠弯曲菌检验程序见图1。

9操作步骤

9.1样品采集

9.1.1家禽泄殖腔或家畜直肠棉拭子样品

用无菌棉签采集家禽泄殖腔内或家畜直肠内粪便约0.1g,放入Cary-Blair运输培养基中保存

9.1.2 家禽或家畜粪便拭子样品

用无菌棉签采集家禽或家畜的新鲜粪便约0.1g,放入Cary-Blair 运输培养基中保存

9.1.3 禽蛋样品

9.1.3.1 禽蛋蛋黄液或蛋浆样品

将禽蛋样品分别放入无菌采样袋中,固定在运输蛋托中保存,在无菌条件下吸取蛋黄液或蛋浆

9.1.3.2禽蛋表面擦拭样

用无菌棉签擦拭禽蛋表面,放入无菌采样袋中封口保存。

9.1.4鲜奶样品

用无菌采样袋或无菌采样管采集鲜奶样品约50m,封口保存，

9.1.5 饲料样品

用无菌镊子夹取养殖场贮藏的饲料或垫料10g,分别放入无菌采样袋中封口保存。

9.1.6养殖环境样品

9.1.6.1 环境擦拭样

用无菌棉签擦拭养殖环境的地面、参与养殖人员的鞋底,放入无菌采样袋中封口保存。

9.1.6.2饲料和垫料样品用无菌镊子夹取养殖环境中的饲料和垫料10g,分别放入无菌采样袋中封口保存。

9.1.7 水样品取养殖场家禽或家畜的饮用水11~4L和养殖环境中的污水20ml~50ml,放入无菌采样瓶中保存。

9.1.8肠内容物棉拭子样品

用无菌剪刀剪开盲肠,用无菌棉签采集肠道内容物,放入Cary-Blair 运输培养基中保存。

9.1.9屠宰肉样品

9.1.9.1 肉表面擦拭样品

用无菌棉签擦拭样品的表面(面积至少100cm),放入无菌采样袋中封口保存

9.1.9.2 大块肉样品

用无菌采样袋采集大块肉样品约100g,封口保存

9.2样品运输

样品运输过程中,应避光保存,保存温度为0℃~20℃,样品应在24h内进行处理。如果采样与样品处理的间隔时间较长,样品应在4℃士2℃中低温保存,并在72h内进行处理。

9.3样品处理及增菌

9.3.1泄殖腔或直肠棉拭子、粪便棉拭子及肠内容物棉拭子样品处理

将棉拭子插人装有1mLPBS的1.5mL离心管内浸泡20min,振荡数次,至眼观粪渣完全重悬,立即取悬浊液 100 L,涂布于 mCCDA 平板上,置于恒温培养箱中,42 ℃士1℃微需氧条件下培养 24 h~48 h.

9.3.2禽蛋蛋黄液或蛋浆样品处理

取 25ml蛋黄液或蛋浆样品加入125mlBolton肉汤中均质混合(1∶6稀释),取25ml,混合液加人100ml,Bolton肉汤中并混匀(1:30稀释),同时将1:6和1:30稀释的混合液分别置于恒温振荡培养箱中,42℃士1℃微需氧条件下培养24h~48h,进行增菌。

9.3.3 鲜奶样品处理

将 50 mL,鲜乳样品在4 ℃下10 000 r/min离心 30 min后弃去上清液,用10 mL Bolton 肉汤重悬沉淀(尽量避免带人油层),将悬浊液转移至90mlBolton肉汤中,置于恒温振荡培养箱中,42℃士1℃微需氧条件下培养24h~48h,进行增菌

9.3.4表面擦拭样品处理

用无菌剪刀将禽蛋、肉表或环境表面擦拭样的棉签头直接剪落到100mlBolton肉汤中,置于恒温振荡培养箱中,42℃士1℃微需氧条件下培养24h~48h,进行增菌。

9.3.5大块肉样品处理

将200ml0.1%蛋白胨水加入样品采样袋中,振荡2min~3min,充分冲洗样品。将处理后的0.1%蛋白陈水转移至250mL离心管中,在4℃下5000r/min离心15 min后弃去上清液,用10 ml0.1%蛋白胨水重悬沉淀,吸取3ml悬浊液,加人100ml, Bolton肉汤中,置于恒温振荡培养箱中，42℃士1℃微需氧条件下培养24 h~48 h,进行增菌。

9.3.6饲料和垫料样品处理

将90mLPBS加入放有10g饲料或垫料样品的无菌采样袋中,用均质器速均质1min,吸取10 ml,均质液加人 90 ml, Bolton 肉汤中,置于恒温振荡培养箱中,42℃+1℃微需氧条件下培养24 h~48 h,进行增菌。

9.3.7水样品处理

用0.22μm滤膜过滤水样进行富集,并将富集后的滤膜置于5mlBolton肉汤中;或将水样在4 ℃条件下5 000 r/min 离心 10 min,去除上清液后,加人5ml Bolton肉汤将沉淀物重悬。处理后的样品置于恒温振荡培养箱中,42℃士1℃微需氧条件下培养24h~48h,进行增菌。

9.3.8样品增菌后处理

用PBS将24h增菌液和48h增菌液分别进行1:50的稀释,将100mL增菌液及对应的1:50稀释液分别划线接种于弯曲菌选择性mCCDA平板上,置于恒温培养箱中,42℃士1℃微需氧条件下培养24 h~48 h。

9.4弯曲菌的分离

观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态,弯曲菌在mCCDA平板上的疑似菌落通常为淡灰色、有金属光泽、潮湿、扁平,呈扩散生长的倾向。挑取疑似弯曲菌的单菌落,接种于MHA血平板上,在37℃士1℃或42℃士1℃微需氧条件下培养24 h~48 h。

将空肠弯曲菌标准株NCTC11351接种于MHA血平板上,在37℃+1℃或42℃±1℃微需氧条件下培养24h~48h,作为阳性对照。

9.5 弯曲菌的生化鉴定

9.5.1 弯曲菌属的生化鉴定

关于弯曲菌属的生化鉴定,按GB4789.9-2014中5.4.1的实验方法进行操作

9.5.2空肠弯曲菌生化鉴定

关于空肠弯曲菌的生化鉴定,按GB4789.9-2014中5.4.2的实验方法进行操作

9.6 弯曲菌的多重PCR鉴定

9.6.1 多重PCR模板的制备

在 1.5ml,离心管中,加人100μl,灭菌超纯水,用无菌接种环挑取弯曲菌选择性 mCCDA 平板上的弯曲菌疑似单菌落4~5个,放置于干式恒温金属浴中100℃处理10min,冷却后,以12 000 r/min 离心2min,上清液作为多重 PCR反应的细菌 DNA模板。同时,制备空肠弯曲菌标准株 NCTC11351的DNA模板作为阳性对照,以结肠弯曲菌作为其他弯曲菌对照,以超纯水作为阴性对照。

9.6.2 多重PCR反应程序

参考A.5制备25L多重PCR反应体系。在基因扩增仪设置多重PCR反应程序:95℃预变性10min;95 ℃变性 30s,59 ℃退火 90s,72 ℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min。反应结束后置于4℃保存。

9.6.3 凝胶电泳分析

取9μL多重PCR产物和1μL的10XDNA凝胶加样缓冲液均匀混合,并与5L介于100bp~2 000bp的DNA分子量标准分别加人1.2%的琼脂糖凝胶点样孔中,进行电泳。电泳缓冲液为0.5XTBE,电压110V,电泳时间20min~30min。电泳结束后用凝胶成像仪进行成像分析,通过介于100bp~2000bp的DNA分子量标准的已知条带长度判断菌落的PCR条带长度。

9.6.4 结果判定

9.6.4.1 多重PCR反应程序有效性判定

空肠弯曲菌阳性对照同时出现857bp弯曲菌属特异性扩增条带及539bp空肠弯曲菌的特异性扩增条带,表明阳性对照结果正确。阴性对照无扩增条带,表明阴性对照结果正确。当阳性对照和阴性对照同时正确时,判定多重PCR反应程序有效。凝胶成像仪中阳性对照和阴性对照扩增结果见 A.9.3

9.6.4.2 阳性结果判定

同时出现857bp和539bp扩增条带的样品判定为空肠弯曲菌核酸阳性

9.6.4.3 阴性结果判定

未同时出现857bp和539bp扩增条带的样品判定为空肠弯曲菌核酸阴性