高通量测序 (HTS)：原理、步骤、用途

高通量测序（HTS）介绍

高通量测序（HTS）是一种能够在单次运行中同时处理多个样本的测序技术，它比传统的测序方法更快、更高效。

这种技术也被称为下一代测序(NGS)或大规模并行测序。它能够迅速处理大量的遗传信息，帮助我们更深入地理解基因的功能及疾病的进展。

早期的测序技术，比如桑格测序法，速度较慢且一次只能处理一个样本，因此被认为是低通量的方法。而今，像Illumina和Oxford Nanopore这样的高通量测序平台已经非常成熟。它们不仅具有高通量的特点，还成为了当前测序项目中的首选工具。

目前已经研发出了多种不同的高通量测序平台，能够在一次实验中生成数百万个DNA或RNA序列。其中一些HTS方法专注于对特定基因的特定区域进行测序，这被称为靶向测序。除此之外，还有针对整个基因组或仅限于编码区的测序方法，分别称为全基因组测序(WGS)和全外显子组测序(WES)。此外，HTS技术也被广泛应用于转录组分析和表观基因组学研究。

高通量测序HTS

高通量测序（HTS）原理

高通量测序（HTS）的核心在于大规模并行测序技术，它能够在短时间内对多个DNA片段同时进行测序，从而生成海量数据。这项技术包括将大型的DNA或RNA分子切割成较小的片段，随后对这些片段进行同步测序。

具体来说，首先需要从目标生物材料中提取并破碎所需的遗传物质。接着，会将这些小片段连接到特制的短DNA序列——接头上，这有助于在后续的测序过程中识别和重组这些序列。当这些片段准备就绪后，利用如Illumina等HTS平台进行扩增和测序。最终，通过各种生物信息学软件对获得的数据进行分析。

高通量测序HTS

高通量测序（HTS）的流程/步骤

样品制备：这一阶段的任务是从选定的生物样本中提取DNA或RNA，作为后续测序的基础材料。

文库制备：提取的核酸会被切成小段，并加上特殊的测序接头。这些接头对于序列的对齐和组装至关重要。之后，这些片段会被扩增，形成含有多个拷贝的测序文库。

测序：将准备好的文库加载到测序仪器上。测序机通过逐个添加核苷酸来构建新的DNA链，同时记录每次添加的具体碱基。HTS平台能够生成大量的原始测序数据，这些数据需经过进一步处理才能转化为有用的信息。

数据分析：这是最后一个步骤，涉及原始数据的处理、与参考基因组的比对以及遗传变异或表达模式的识别。首先进行的是预处理和质量控制，以保证测序数据的质量，比如去除低质量的读数和修剪接头序列。随后，将序列读数与参考基因组或转录组进行映射和比对。接下来是检测遗传变异，如突变或结构上的变化。最后，进行功能注释和通路分析，以解读这些基因的生物学意义。

高通量测序（HTS）平台

目前市面上有几种常用的商业HTS平台，包括Illumina、Ion Torrent、Pacific Biosciences（PacBio）和Oxford Nanopore Technologies。

Illumina：由于其高精度、灵活性和经济性，Illumina是目前最广泛使用的HTS技术之一。它提供了多种针对不同应用场景设计的测序设备，如MiSeq适用于靶向测序和小型基因组，HiSeq则更适合于需要大量数据的项目。

Ion Torrent：对于某些应用，如需要快速结果的临床诊断，Ion Torrent提供了一个更快、更经济的选择。不同于基于荧光检测的传统方法，Ion Torrent通过测量测序过程中DNA碱基添加导致的pH值变化来工作。尽管其速度和多功能性突出，但较高的错误率限制了其在某些领域的应用。

PacBio：PacBio使用单分子实时（SMRT）测序技术，无需先扩增DNA即可直接测序，减少了可能产生的偏差。这种方法特别适合于需要长读取长度的应用，如从头组装基因组和研究结构变异。然而，它也伴随着较高的错误率。

Oxford Nanopore Technologies：这家公司的技术基于纳米孔测序，即DNA分子通过微小的孔道移动，随着每个碱基穿过孔道，电流的变化被用来确定序列。Oxford Nanopore的产品以便携性、长读取能力和实时数据生成著称，尽管其错误率相对较高，但在现场作业和紧急测序任务中展现出巨大潜力。MinION是该公司2014年推出的首个商业化纳米孔测序器，能够产生长读长并具备快速测序的能力。

高通量测序HTS

高通量测序（HTS）的优势

高通量测序（HTS）技术能够在单次运行中处理多个样本，大大提升了测序的速度和效率，比传统测序方法更快。它能够在短时间内生成大量测序数据，这对于临床诊断和研究中的快速检测非常关键。对于大型项目而言，HTS更加经济实惠，因为可以在同一测序过程中同时处理多个样本，降低了每个样本的总体成本。

HTS能够一次性生成大量数据，提供全面的遗传分析所需的信息。此外，HTS的应用范围广泛，从全基因组测序到靶向测序都能胜任，显示出高度的灵活性。现代HTS技术不仅精度高，而且能有效减少测序错误，生产出高质量的测序数据。

高通量测序（HTS）的局限性

尽管HTS能够显著降低每个样本的成本，但其初期设置成本可能相当高。购买设备和建立必要的计算基础设施需要较大的前期投资，这可能是一些实验室采用该技术的一大障碍。

结此外，管理和存储HTS产生的大量数据也是一个挑战，需要高级的计算工具和技术知识。某些基因组区域，如GC含量丰富区和长均聚物序列，难以准确测序。多数HTS平台产生的读长较短，这限制了其在准确描述大型重复区域和分析复杂结构变化方面的应用能力。

高通量测序（HTS）的应用

HTS技术使得全基因组测序（WGS）成为可能，可以一次性完成整个基因组的测序，这对于研究生物体的全部基因组成至关重要。HTS还支持全外显子组测序（WES），即对基因组中大约1-2%的蛋白质编码区域进行测序。

在医学研究领域，HTS被用来探索遗传性疾病、识别突变以及开发个性化治疗方案，对于理解和治疗罕见病和癌症等遗传疾病具有重要意义。

此外，HTS技术还被应用于从头基因组测序、遗传变异研究、绘制DNA甲基化模式以及转录组学研究，如RNA测序等，这些都为了解基因表达和RNA转录本提供了详细的见解。通过ChIP-seq等HTS方法，科学家们能够绘制出DNA相关蛋白（如组蛋白和转录因子）的结合位点图谱，加深了对基因调控机制和染色质结构的理解。

感染后是否发病依据可疑症状(低热、盗汗、疲乏、食欲减退、清瘦、咳嗽、咳咳血)、X线改变及病原学检查来判定痰、肺结核的实验室诊断方法主要有痰涂片检查，该检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病，但阳性率低是美中不足之处。痰结核菌培养结果可信度高，一般2~3周肉眼可见菌落，但个别菌需时6~8周，应用受到限制。

肺结核病辅助检查主要方法常用的有结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验，该试验阳性是感染过结核菌的证据之人群是否被结核杆菌感染，用目前的结核杆菌素蛋白衍生物(PPD)试验难以得出可靠的结论。因为该衍生物所包含的抗原为致病性分枝杆菌、环境中的分枝杆菌及卡介菌所共有，不能明确区分BCG免疫、外界分枝杆菌感染和致病性结核杆菌感染，对卡介苗接种或者早期曾经感染但体内未有存活结核杆菌依然呈阳性反应。PPD阳性只能代表其曾经感染，无法判断其是否发病或处于潜伏感染状态，意义不大。其他辅助诊断方法有结核抗体检测、BACTEC法测结核分枝杆菌的代谢物、聚合酶链反应(PCR)快速检测等

HTS还在微生物组研究中发挥了重要作用，例如通过宏基因组测序和16S rRNA基因测序，揭示不同环境中微生物群落的多样性。

高通量测序HTS

参考资料

Chauhan, T. (2024, February 3). What is High Throughput Sequencing and How Does It Work? Retrieved from https://geneticeducation.co.in/high-throughput-sequencing/

Churko, J. M., Mantalas, G. L., Snyder, M. P., & Wu, J. C. (2013). Overview of high throughput sequencing technologies to elucidate molecular pathways in cardiovascular diseases. Circulation research, 112(12), 1613–1623. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.113.300939

Lee J. Y. (2023). The Principles and Applications of High-Throughput Sequencing Technologies. Development & reproduction, 27(1), 9–24. https://doi.org/10.12717/DR.2023.27.1.9

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更新日期：2024-10-31

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