实验指南 | 乳酸菌的分离

一、目的要求

1.学习分离酸奶中乳酸菌的方法。

2.学习稀释液制备的方法。

3.学习平板涂布的方法。

二、基本原理

稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即由一个单细胞繁殖而成的培养特征设计的计数方法，一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使之以单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个细胞)，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后统计由单个细胞生长繁殖形成菌落的数目，即可计算出样品中的含菌数此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。稀释平板计数法一般用于某些成品检定(如杀虫菌剂等)、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源污染程度的检验。

三、器材

1.培养基

MRS培养基。

2.仪器及其他用具

酒精灯，无菌培养皿，无菌涂布器，接种环，移液器，无菌枪头，封口膜等。

3.试剂

无菌水，草酸铵结晶紫染液(初染)，卢戈氏碘液(媒染)，蕃红溶液(复染)。

4.实验材料

外购酸奶。

四、操作步骤

第一步:梯度平板稀释法分离乳酸菌

用一支1m无菌吸管从酸奶中吸取1m乳酸菌液加入盛有9mL无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL，加入另一盛有9mI无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10'、10²、10³、10^4、10^5、10^6不同稀释倍数的乳酸菌溶液(见图1)。

图1、从酸奶中分离出乳酸菌稀释过程

第二步:平板涂布培养乳酸菌

将上述灭好菌的培养基的三组平板底部分别用记号笔写上10^4、10^5和10^6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10^4、10^5和10^6三管乳酸菌稀释液中各吸取0.1mL对号滴人已写好稀释度的平板中央位置。用无菌涂布器涂布的时候，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次(见图2)。接种后放置于37℃培养箱中培养48h。

图2、平板涂布操作步骤

第三步:观察乳酸菌

1.恒温培养48h后，取出平板;选择菌落分布较好的平板先对其菌落形态(如菌落大小、表面状况、透明度、色泽、边缘、隆起度、透光性、是否分泌色素等特点)进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌菌落很小，大约1~3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暖黄色。

2.乳酸菌形态观察(革兰氏染色法)

(1)涂片取干净载玻片一块，在载玻片中央滴加一滴蒸馏水，将培养的乳酸菌做涂片，干燥、固定。

(2)染色 初染→媒染→脱色一复染→镜检

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更新日期：2024-05-14

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编制人：木木