实验指南 | 厌氧血液琼脂的组成、原理、制备、用途及局限性解析

厌氧血液琼脂的组成、原理、制备、用途及局限性解析

引言：

厌氧血液琼脂是一种固体培养基，适用于对厌氧菌进行初步分离和培养的定性操作，特别适合那些生长要求苛刻及生长缓慢的菌株。此培养基由美国疾病控制和预防中心（Centers for Disease Control and Prevention）位于佐治亚州亚特兰大的V.R. Dowell和T.M. Hawkins共同研发。厌氧血液琼脂能够很好地促进临床重要性显著的各种难养和慢速生长厌氧菌的良好生长和典型色素形成。

图1、厌氧血液琼脂

厌氧血琼脂的组成：

厌氧血液琼脂培养基包含了蛋白质水解产物（如酪蛋白酶解物和大豆酶解物）作为氮源和微量元素来源，酵母抽提物提供了B族维生素和其他生长因子，氯化钠用来维持渗透压平衡，L-半胱氨酸作为还原剂有助于创造厌氧环境，血红素则是某些厌氧菌生长必需的生长因子，而琼脂则作为凝固剂使得培养基成为固体状态，利于菌落的形成和观察。整个培养基经过精确配比和pH调控，适用于厌氧菌的分离和培养。

● 酶解酪蛋白（Casein enzymic hydrolysate）：15.0克

● 大豆粉酶解物（Papaic digest of soybean meal）：5.0克

● 酵母抽提物（Yeast extract）：5.0克

● 氯化钠（Sodium chloride）：5.0克

● L-半胱氨酸（L-Cysteine）：0.50克

● 血红素（Hemin）：0.005克

● 琼脂（Agar）：13.50克

● 蒸馏水：1000 毫升

● pH值：7.4±0.2

厌氧血琼脂的原理：

● 厌氧血液琼脂的基础介质作为一种营养丰富、非选择性的培养基，不仅有利于快速生长的厌氧菌培养，还能容纳需氧菌和微需氧微生物的生长。

● 其中，肽胨提供氮源和氨基酸，这些都是厌氧菌生长所必需的营养成分。

● 酵母抽提物富含B族维生素，可以促进微生物的生长繁殖。

● 血红素、维生素K以及羊血的添加，尤其有利于像拟杆菌属这类厌氧菌和如梭菌属这样的革兰氏阳性芽孢形成菌的生长刺激。

● 氯化钠作为必不可少的电解质来源，有助于维持渗透压平衡。

● 血液的添加则提供了额外的营养成分，并有助于区分溶血性微生物。

厌氧血液琼脂的制备与使用方法：

● 将44.0克的培养基粉末溶解于1000毫升蒸馏水中。

● 加热至沸腾，确保培养基完全溶解。

● 向溶解后的培养基中加入1瓶已复溶的维生素K1溶液。

● 使用高压蒸汽灭菌器，在15磅压力（121°C）下灭菌15分钟。

● 冷却至45-50°C。

● 无菌条件下加入5%体积比的无菌去纤维蛋白绵羊血。

● 充分搅拌均匀后倒入无菌平板培养皿中。

● 在使用前，将平板置于无氧环境中静置至少24小时，室温下还原。

● 实验室收到样本后尽快在选择性和非选择性培养基上接种厌氧培养样品，采用划线法分离纯化。

● 将接种好的平板厌氧条件下于33-37°C下培养48-72小时。

● 通过厌氧血液琼脂平板的转接培养来确认厌氧菌的生长。

厌氧血琼脂的结果解读：

● 脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)：表现出丰富的生长。

● 黑色素生成类杆菌(Bacteroides melaninogenicus)：同样展现出丰富的生长。

● 专性厌氧链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)：也显示出丰富的生长。

● 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)：可生长，并形成双层β溶血环（即周围一圈清晰的溶血区）。

● 核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)：能在培养基上生长。

● Prevotella melaninogenica：可以生长，并产生从浅褐色到深褐色的色素。

● 大肠杆菌(Escherichia coli)：能够在培养基上生长。

● 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：同样可在培养基上生长。

总之，在厌氧血液琼脂上，上述各类微生物均显示不同程度的生长，其中部分菌种还具有特殊的生长特征，如溶血现象或产生色素等，这些特征有助于对微生物种类进行初步识别和区分。

厌氧血琼脂的局限性：

● 厌氧血液琼脂基础培养基适用于临床标本中严格厌氧微生物特别是难养菌株的培养。

● 当向培养基中添加血液后，它能促进黑色素类杆菌（Bacteroides melaninogenicus）典型色素的形成，并能显示出产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的双重溶血反应。

● 此外，该培养基还支持着色普氏菌属（Prevotella）和牙龈卟啉单胞菌属（Porphyromonas）等色素菌种产生典型的色素。

厌氧血琼脂的用途：

● 在准备、分配和包装过程中必须在无氧条件下进行，以防在使用前形成氧化产物，从而影响其对厌氧菌的支持效果。

● 仅依靠厌氧血液琼脂无法提供细菌分离株全面的鉴定信息，还需要配合其他附加检测程序和不同类型的培养基，以完成准确的菌种鉴定。

● 为了保证所有现存物种都能有效生长，建议除了使用厌氧血液琼脂外，还需同时接种临床样本至选择性更强的培养基上，例如含有卡那霉素和万古霉素的厌氧溴化乳糖溶血血液琼脂，或者含有苯乙醇的厌氧布鲁氏菌血液琼脂。这样可以确保对样本中各种厌氧菌种的检出率和多样性。

总结：

厌氧血液琼脂是一种专门设计用于厌氧菌分离培养的固体培养基，由Dowell和Hawkins开发，适用于多种难养和生长缓慢的厌氧菌。该培养基含有酪蛋白酶解物、大豆酶解物、酵母抽提物、氯化钠、L-半胱氨酸、血红素和琼脂等多种成分，确保了适宜的营养条件、渗透压稳定及无氧环境。在制作过程中，需精准控制pH值并经高压蒸汽灭菌，之后加入无菌绵羊血制成平板。尽管厌氧血液琼脂能支持多种厌氧菌如脆弱类杆菌、产气荚膜梭菌等的生长及特性表现（如溶血和色素生成），但其并非全能鉴定工具，需要结合其他选择性培养基和检测手段才能完成准确的菌种鉴别。为了提高临床标本中多样厌氧菌的检出率，推荐同时使用多种选择性培养基进行接种培养。

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更新日期：2024-04-01