详细解读：革兰氏阳性菌和阴性菌的特征特性、革兰氏染色（Gram Staining）的基本原理、试剂材料和步骤实例

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什么是革兰氏染色（Gram Staining）？

革兰氏染色（Gram Staining）是一种差异细菌染色技术，可根据细菌的细胞壁成分将其划分为革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，是细菌学中应用最广泛和最重要的染色技术。革兰氏染色技术由丹麦细菌学家汉斯·克里斯蒂安·格拉姆（Hans Christian Gram）开发使用，最初是用来鉴定引起肺炎的细菌，后来成为将划分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的流行方法。革兰氏染色是识别和观察细菌的一般测试。染色使用结晶紫作为主染色剂，檫木碱作为复染剂。染色后具有革兰氏阳性细胞壁的细菌将呈现紫色，革兰氏阴性菌则会失去原染色并吸收复染剂呈现粉红色或红色。

革兰氏阳性和阴性菌的特性差别

细菌是单细胞微生物，被归类为原核细胞生物。它们的内部结构简单，主要由荚膜、细胞壁、细胞质、核糖体、DNA、菌毛和鞭毛组成。确定细菌的革兰氏特性，需要用到革兰氏染色技术。除了染色特性，革兰氏阳性和阴性菌在各个方面都存在差异，如表所示：

表1、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的特性差异表

在这两者中，革兰氏阴性细菌的危害更大，因为它们比革兰氏阳性菌更加顽固，难以破坏，如果感染是由革兰氏阴性菌引起，一般需要配合使用联合疗法，尤其是具有双重机制作用的抗生素，以彻底清除有害细菌。

基本原理

由于细菌细胞壁结构和组成成分的差异，细胞壁上有一层厚厚的肽聚糖的细菌会抵抗主染色剂脱色，呈现紫色。肽聚糖层较薄、交联较少的细菌在脱色过程中会失去主染色剂，而获得复染色剂，呈现粉红色或红色。

在结晶紫染料溶液中，分子会解离成 CV 和 Cl+- 离子。这些离子很容易穿透阳性和阴性细菌的细胞壁成分。CV 离子与细胞壁中带负电荷的成分相互作用。当加入革兰氏碘媒染剂时，碘（I+- 或 I-3 离子）与 CV 离子相互作用，在细胞质、细胞膜和细胞壁层内形成 CV-I 复合物。

当加入脱色剂（乙醇或乙醇与丙酮的混合物）时，它会与细胞壁中的脂质发生作用。革兰氏阴性细菌细胞壁的外膜被溶解，露出肽聚糖层。由于细胞壁中的肽聚糖层较薄，交联较少，因此会出现渗漏。这导致细胞失去大部分 CVI 复合物。而革兰氏阳性细菌没有外膜，肽聚糖层较厚，交联度较高。因此，脱色溶液会使肽聚糖层脱水，将所有的 CVI 复合物困在细胞壁，细菌就会保持结晶紫的紫色染色。

当添加复染剂（带正电荷的番红素）时，其会与革兰氏阴性细胞壁和膜中带负电荷的游离成分相互作用，细菌变成粉红色/红色。然而，革兰氏阳性菌由于 CVI 复合物和脱水，导致细胞壁内部没有番红的进入空间，不能将其染成红色或粉红色，依旧呈现紫色。

图1、革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁差异    来源： https://encyclopedia.thefreedictionary.com/Gram+Staining

准备物品

实验细菌、革兰氏染色试剂盒（试剂）、载玻片、接种环、本生灯、染色架、洗瓶（或自来水）、带100倍物镜的显微镜（复合显微镜）、革兰氏染色试剂

革兰氏染色试剂

1、原染剂（结晶紫）

结晶紫是一种浓紫色的有机化合物，化学上被称为三苯基甲烷染料，又称六甲基对玫瑰苯胺氯化物或甲基紫10B或龙胆紫。其颜色取决于溶解介质的pH值，在pH 值在1以下时呈黄色，在pH值为1-2时呈绿色，在中性pH值下呈紫色（深蓝紫色），在高碱性pH值下呈无色。结晶紫常被用于染色纺织品、纸张和纤维、圆珠笔以及洗涤剂、化肥等化学品。在微生物学和分子生物学中，它常被用于细菌染色、组织学玻片染色、DNA染色等。同时，它还具有抗菌和抗真菌特性，因此可被用于灭菌和消毒。在革兰氏染色中，它作为原染剂被用作CV+和Cl-离子化的碱性染料，为革兰氏阳性菌提供紫色。

2、媒染剂（革兰氏碘）

革兰氏碘是碘和碘化钾的水溶液，在革兰氏染色中用作媒染剂。它与 CV+ 相互作用并形成 CVI 复合物，该复合物被困在革兰氏阳性细胞壁的脱水肽聚糖层中。

3、脱色剂

脱色剂为乙醇或丙酮和乙醇（95%）按体积比为1：1配置的混合物，脱色液溶解革兰氏阴性细胞壁外膜中的脂质，增加其渗透性。而在革兰氏阳性细胞壁中，脱色剂使肽聚糖层脱水，并将 CVI 复合物捕获在细胞内。

4. 复染剂（番红素）

番红素是一种红色复染剂，用于在革兰氏染色技术中对脱色的革兰氏阴性细胞进行重新染色。它是一种碱性染料，与细胞壁和膜的带负电荷的成分相互作用。除番红素外，稀卡波尔品红溶液也可被用作复染剂。

革兰氏染色步骤

1、革兰氏染色试剂制备

结晶紫制备：在 100 毫升乙醇（95%）中加入 20 克 85% 的结晶紫染料，充分混合溶解；在 100 毫升蒸馏水中加入 1 克草酸铵，充分混合溶解；在 10 毫升蒸馏水中加入 1 毫升结晶紫原液，再加入 40 毫升草酸盐原液；溶液室温放置 24 小时，保存在深色瓶中备用。

革兰氏碘制剂：将 1 克碘和 2 克碘化钾溶解在 300 毫升蒸馏水中，适当混合直至碘溶解，保存在深色瓶备用。

脱色液：将50毫升丙酮与50毫升95%乙醇混合。

番红素：将2.5克番红素与100毫升 95%乙醇混合，将上述溶液10毫升与蒸馏水90毫升混合。

卡波尔-品红：将3克碱性品红溶解在100毫升 95%乙醇中，将5ml液体苯酚与95毫升蒸馏水混合，制成5%苯酚溶液，将10毫升碱性品红溶液与100毫升5%苯酚溶液混合，室温下静置 24 小时，存放在深色瓶子中。

2、染色玻片制备

取一个干净、透明、无油脂的载玻片

通过燃烧对接种环进行灭菌，并在载玻片中间转接一满环的细菌培养悬液。

如果培养物在培养皿或倾斜的培养皿上，则在载玻片中间滴一滴水，然后用无菌接种环移取少量菌落并与水滴一起悬浮。

用无菌接种环铺开悬浮液以制备薄涂片。涂片不能太薄或太厚。

让涂抹片风干，然后通过加热固定。固定时应使用微火。玻片必须在受热均匀，以防过热。加热会将细菌细胞固定在载玻片上，防止它们被冲走。

3、染色实验

将结晶紫溶液注入固定涂片，30 - 60 秒后，倒掉结晶紫溶液并用流动的清水冲洗。

在涂片上滴加革兰氏碘溶液，让碘溶液停留 30 - 60 秒，倒掉多余的碘，用流动的清水冲洗，甩干涂片上多余的水。

用脱色液对涂片进行脱色，直至呈透明状流下。或者加入几滴脱色溶液，轻轻摇晃，5 秒钟后用蒸馏水冲洗。

用蒸馏水冲洗脱色剂，甩干涂片上多余的水，在涂抹处倒入反染色剂 。

静置 30 - 60 秒，然后用流动的清水冲洗，晾干或吹干涂抹物。

图2、革兰氏染色的实验步骤    来源： https://microbenotes.com/gram-stain-principle-reagents-procedure-and-result-interpretation/

显微镜观察

将带有革兰氏染色风干涂片的载玻片放在复合显微镜的载物台上，并用载物台夹固定。

移动载物台，将光线聚焦在涂抹物上，对准 10 倍物镜并使用粗调旋钮聚焦涂抹。

将物镜更改为 40 倍并使用微调旋钮对焦，旋转鼻梁，使污点落在 40 倍和 100 倍物镜之间。

在涂抹上加入一滴浸油，旋转鼻托，使 100X 油浸物镜对准涂抹。

使用微调旋钮聚焦显微镜并研究细菌。

图2、革兰氏染色结果对比    来源：https://microbenotes.com/gram-stain-principle-reagents-procedure-and-result-interpretation/

革兰氏染色的应用

将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，用于实验室诊断，鉴定病原体，研究细菌形态等

革兰氏染色的局限性

不能对抗酸杆菌（分枝杆菌属）和没有细胞壁的细菌（如支原体属）进行染色。

不适用于微小细菌，如立克特氏菌属、衣原体属等。

需多种试剂，过度脱色可能导致假阴性结果，而脱色不足可能导致假阳性结果。

涂片太厚或太粘稠可能会保留过多主染色，使识别革兰氏染色反应变得困难，革兰氏阴性菌可能无法正常脱色。

死亡细胞无法保留染色剂，随着老化，污渍可能形成沉淀物。

接受抗生素或抗菌治疗的患者的革兰氏染色可能改变了革兰氏染色的反应性。

有时涂片中的下呼吸道肺炎球菌不会在培养物中生长。

专性厌氧菌，如梭状芽胞杆菌、葡萄球菌和链球菌等产毒素微生物可能会破标本中的白细胞。

参考文献

1、Thetner, D. (2000), “Triphenylmethane and related dyes”, Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Wiley, doi:10.1002/0471238961, ISBN 9780471484943.

2、Bartholomew, J. W. and Finkelstein, H. (1958). Relationship of cell wall staining to Gram differentiation. J. Bacteriol., 75(1): 77-84.

3、Gram stain | Principle | Steps | Interpretation | Tips (microbiologie-clinique.com)

4、Gram Staining : Principle, Procedure, Interpretation and Animation – Laboratoryinfo.com

5、 Gram Staining: Principle, Procedure, Interpretation, Examples and Animation (microbiologyinfo.com)

6、 https://zh.wikipedia.org/wiki/革兰氏阴性菌

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更新日期：2023-11-08