过氧化苯甲酰对皮肤疾病相关病原体的广谱体外抑菌作用研究

摘要

本研究考察了过氧化苯甲酰（BPO）对多种皮肤疾病相关病原体的体外杀微生物活性，包括痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、 表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、白念珠菌（Candida albicans）、 糠秕马拉色菌（Malassezia furfur）、限制马拉色菌（Malassezia restricta）和球形马拉色菌（Malassezia globosa）。

将上述菌株在含有0.25、0.5、1或2 mmol/L过氧化苯甲酰的磷酸盐缓冲液（补充0.1%甘油和2% Tween 80）中孵育1小时。 暴露于过氧化苯甲酰后，革兰氏阳性菌和真菌的活菌计数显著下降，而革兰氏阴性菌的计数未见明显变化。透射电子显微镜（TEM）图像显示，暴露于2 mmol/L过氧化苯甲酰后， 痤疮丙酸杆菌和限制马拉色菌的电子密度降低，且细胞壁遭到破坏。

综上所述，本研究表明过氧化苯甲酰对与多种皮肤疾病相关的革兰氏阳性菌和真菌具有强效且快速的杀微生物活性， 直接破坏细菌细胞壁是其发挥快速、强效杀微生物活性的关键机制。

引言

过氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide, BPO）被广泛用作治疗寻常痤疮的外用药物，具有角质溶解/粉刺溶解、抗炎作用以及对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性。 我们前期研究已证实BPO对痤疮丙酸杆菌具有快速且强效的杀菌活性。BPO可迅速降解为苯甲酸并产生自由基，据推测这会对细菌细胞壁造成损伤。 因此，BPO可能对痤疮丙酸杆菌以外的其他微生物也具有抑菌作用。

Akaza等人报道指出，除痤疮丙酸杆菌外，其他皮肤常驻微生物（如葡萄球菌属和马拉色菌属）也可能与痤疮的发病机制有关。在本研究中，我们系统考察了BPO对多种细菌和真菌的体外杀微生物活性， 旨在阐明其广谱抗菌作用机制及其在皮肤疾病治疗中的潜在应用价值。

一、材料与方法

1、实验菌株

本研究所用微生物包括：

细菌：痤疮丙酸杆菌ATCC11827、金黄色葡萄球菌ATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC12228、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853

真菌：白念珠菌ATCC90028、糠秕马拉色菌ATCC14521、限制马拉色菌ATCC MYA-4611、球形马拉色菌ATCC MYA-4612

2、培养条件

痤疮丙酸杆菌：在补充5%兔血的厌氧哥伦比亚琼脂上，使用AnaeroPack系统在35°C厌氧条件下培养72小时

金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌：在Mueller-Hinton琼脂上，35°C需氧条件下培养24小时

白念珠菌：在沙氏琼脂上，32°C需氧条件下培养24小时

糠秕马拉色菌和球形马拉色菌：在改良Leeming and Notman琼脂上，32°C需氧条件下培养3或7天

限制马拉色菌：在改良Leeming and Notman琼脂上，使用AnaeroPack系统在32°C微需氧条件下培养5-7天

3、杀微生物活性测定

采用体外测定法评估BPO的杀菌活性。将培养后的细菌和真菌悬浮于补充0.1%甘油和2% Tween 80的磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度约为10^6菌落形成单位（CFU）/mL。将溶于二甲基亚砜（DMSO）的BPO加入菌悬液中，终浓度分别为0.25、0.5、1和2 mmol/L（DMSO终浓度为3%）。在35°C需氧条件下孵育1小时后，取100 µL菌悬液进行系列稀释，涂布于琼脂平板上，在相应生长条件下培养。计数菌落数（检测限为1.60 log CFU/mL）。 为研究外膜对BPO杀灭革兰氏阴性菌的影响，将大肠埃希菌和铜绿假单胞菌在含100 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS中，35°C需氧预孵育1.5小时。经PBS洗涤两次后，测定BPO的杀菌活性。

4、透射电子显微镜（TEM）观察

将菌株在35°C需氧条件下暴露于2 mmol/L BPO 1小时。细胞经含2.5%戊二醛的0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液4°C固定过夜，PBS洗涤后，用含1.5%高锰酸钾的水溶液4°C后固定16小时。丙酮脱水后，样品包埋于普通树脂中。使用H-7600透射电子显微镜（Hitachi，200 kV）观察超薄切片并拍照。

5、统计分析

每项测定均重复三次。使用EXSUS ver. 8.0.0软件通过Dunnett多重比较检验和Student's t检验进行统计分析，P值<0.05认为具有统计学显著性。

二、结果

1、BPO对细菌的杀微生物活性

如图1所示，暴露于0.5、1和2 mmol/L BPO后，痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的菌落数显著减少（P<0.05）。铜绿假单胞菌仅在暴露于2 mmol/L BPO时菌落数有所下降，而大肠埃希菌在任何浓度的BPO处理后菌落数均未见显著减少。经EDTA预处理的铜绿假单胞菌和大肠埃希菌在暴露于2 mmol/L BPO 1小时后，菌落数显著减少（P<0.05）。

图1：过氧化苯甲酰对多种细菌菌株的杀微生物活性。 痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）ATCC11827 (a)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC29213 (b)、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC12228 (c)、 大肠埃希菌（Escherichia coli）ATCC25922 (d) 和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853 (e) 分别与 0.25、0.5、1 或 2 mmol/L 的过氧化苯甲酰（BPO）共同孵育 1 小时。 孵育后，收集细菌悬液并涂布于琼脂平板上以计算活菌数。数据以三次重复实验的均值 ± 标准差表示。CFU，菌落形成单位；C，对照组；BDL，低于检测限（<1.60 log CFU/mL）。*P < 0.05，**P < 0.01，与对照组相比（Dunnett 多重比较检验，双侧）。

2、BPO对真菌的杀微生物活性

如图2所示，白念珠菌仅在暴露于2 mmol/L BPO时菌落数显著减少（P<0.05）。相反，糠秕马拉色菌、限制马拉色菌和球形马拉色菌在暴露于0.25、0.5、1和2 mmol/L BPO后菌落数均显著减少（P<0.05）。

图2：过氧化苯甲酰对多种真菌菌株的杀微生物活性。 白念珠菌（Cutibacterium albicans）ATCC90028 (a)、糠秕马拉色菌（Malassezia furfur）ATCC14521 (b)、限制马拉色菌（Malassezia restricta）ATCC MYA-4611 (c) 和球形马拉色菌（Malassezia globosa）ATCC MYA-4612 (d) 分别与 0.25、0.5、1 或 2 mmol/L 的过氧化苯甲酰（BPO）共同孵育 1 小时。 孵育后，收集真菌悬液并涂布于琼脂平板上以计算活菌数。数据以三次重复实验的均值 ± 标准差表示。CFU，菌落形成单位；C，对照组；BDL，低于检测限（<1.60 log CFU/mL）。**P < 0.01，与对照组相比（Dunnett 多重比较检验，双侧）。

3、BPO对细胞形态的影响

透射电子显微镜观察显示（图3），暴露于2 mmol/L BPO后的痤疮丙酸杆菌和限制马拉色菌表现出粗糙且模糊的细胞壁。在痤疮丙酸杆菌中，细胞壁发生部分破裂，细胞质内容物释放到细胞外。在限制马拉色菌中，细胞壁发生膨胀，且其电子密度明显降低。这些形态学变化表明BPO直接破坏了这些菌株的细胞壁结构。

图3：暴露于过氧化苯甲酰后痤疮丙酸杆菌与限制马拉色菌的形态学变化。 将痤疮丙酸杆菌（C. acnes）和限制马拉色菌（M. restricta）暴露于 2 mmol/L 的过氧化苯甲酰（BPO）中 1 小时，并通过透射电子显微镜观察其形态学变化。 对照组痤疮丙酸杆菌 (a)、经 2 mmol/L BPO 处理的痤疮丙酸杆菌（放大倍数：×60,000）(b)、对照组限制马拉色菌 (c) 以及经 2 mmol/L BPO 处理的限制马拉色菌（放大倍数：×20,000）(d)。

三、讨论

1、BPO的广谱抗菌活性

本研究结果表明，过氧化苯甲酰在1小时内对革兰氏阳性菌和真菌表现出强效且快速的杀微生物活性。 具体而言，在暴露于2 mmol/L BPO后的15、30和60分钟，痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和马拉色菌属的活菌计数均显著下降。 特别值得注意的是，马拉色菌属对BPO的敏感性高于其他细菌，这可能与其细胞壁结构特点有关。

2、作用机制分析

马拉色菌的细胞壁外包裹着一层富含脂质的外层，而BPO是一种高度亲脂的化合物，因此可能比细菌细胞壁更容易穿透马拉色菌的细胞壁。 这一特性解释了为什么马拉色菌对BPO表现出更高的敏感性。透射电子显微镜观察结果进一步证实，BPO直接破坏了痤疮丙酸杆菌和限制马拉色菌的细胞壁结构，导致细胞内容物泄漏和细胞死亡。

3、临床意义

据报道，马拉色菌属（尤其是球形马拉色菌和限制马拉色菌）参与了寻常痤疮的发病机制。BPO对这些马拉色菌的杀微生物活性可能有助于其治疗痤疮的临床疗效。 此外，多种马拉色菌作为人类皮肤共生菌，与花斑癣、马拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特应性皮炎和银屑病等多种皮肤疾病有关。先前研究显示，在这些疾病患者中分离出的优势菌种为球形马拉色菌和限制马拉色菌。

4、革兰氏阴性菌的耐药机制

本研究发现BPO对革兰氏阴性菌的杀菌活性较弱，这与革兰氏阴性菌具有外膜结构有关。革兰氏阴性菌的外膜可作为阻挡大分子和亲水性物质的渗透屏障。 EDTA作为螯合剂，通过与外膜中的二价金属离子（如Ca2+或Mg2+）形成螯合物来破坏外膜结构，从而使BPO能够发挥杀菌作用。这一结果表明，BPO对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的杀菌活性受到其外膜结构的阻碍。

四、结论

本研究表明，过氧化苯甲酰对与多种皮肤疾病相关的革兰氏阳性菌和真菌具有强效且快速的杀微生物活性。直接破坏细菌细胞壁是BPO发挥快速、强效杀微生物活性的关键机制。这些发现为理解BPO的广谱抗菌作用机制及其在皮肤疾病治疗中的应用提供了重要的实验依据。

参考文献

Sagransky M, Yentzer BA, Feldman SR. Benzoyl peroxide: a review of its current use in the treatment of acne vulgaris. Expert Opin Pharmacother. 2009;10:2555–62.

Decker LC, Deuel DM, Sedlock DM. Role of lipids in augmenting the antibacterial activity of benzoyl peroxide against Propionibacterium acnes . Antimicrob Agents Chemother. 1989;33:326–30.

Nakatsuji T, Kao MC, Fang J‐Y, Zouboulis CC, Zhang L, Gallo RL, et al. Antimicrobial property of lauric acid against Propionibacterium acnes: its therapeutic potential for inflammatory acne vulgaris. J Invest Dermatol. 2009;129:2480–8.

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HZB358662：痤疮丙酸杆菌ATCC 11827 | Cutibacterium acnes (VPI 4979)

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HZB356578：表皮葡萄球菌ATCC12228 | Staphylococcus epidermidis

HZB364114：铜绿假单胞菌ATCC 27853 | Pseudomonas aeruginosa

HZB305845：白色念珠菌ATCC 90028 | Candida albicans

HZB303520：糠秕马拉色菌ATCC 14521 | Malassezia furfur

HZB303523：限制马拉色菌ATCC MYA-4611 | Malassezia restricta

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更新日期：2026-06-29

编制人：大刘

审稿人：叶凡