实验分析报告：硫还原地杆菌培养物沉淀颜色变化的原因分析

撰写人：实验员
撰写日期：2026年5月30日
补充日期：2026年7月3日

1 实验背景与问题陈述

硫还原地杆菌（Geobacter sulfurreducens PCA，DSM 12127）是δ-变形菌纲中一种严格厌氧、具有异化铁还原能力的模式菌株。

本实验室采用，含富马酸钠或Fe³⁺柠檬酸铁的改良厌氧培养基进行常规培养。

在连续传代过程中，观察到沉淀颜色发生了以下变化（富马酸盐为主，微量柠檬酸铁）：
早期：培养液静置后，瓶底及瓶壁可见粉红褐色沉淀，培养液呈浅棕色；

早期硫还原地杆菌在试管中的培养照片，静置（左）和摇晃（右）

中期：沉淀颜色转变为白色，摇动后呈絮状悬浮，并快速沉降。

硫还原地杆菌在试管中生成白色沉淀的培养照片，静置（左）和摇晃（右）

后期：沉淀颜色逐渐转变为黑色。

以柠檬酸铁作为主要电子受体的培养照片，空培（左）和 接种生长后（右）

本报告遵循，规范实验分析流程，对现象展开归因分析与验证。

2 原因分析

沉淀颜色的化学解析

红褐色沉淀： 在正常厌氧培养中，菌体以Fe³⁺为电子受体，通过细胞色素c蛋白，将电子传递至胞外Fe³⁺，将其还原为Fe²⁺。

Fe²⁺与磷酸根结合形成磷酸亚铁（Fe₃(PO₄)₂·8H₂O，蓝铁矿），在无定形或微晶状态呈蓝绿色至褐绿色，混合价态呈现典型的红褐色。

白色沉淀： 当培养基中的硫源（硫酸盐或半胱氨酸）被菌株利用时，菌株可能将电子受体切换为SO₄²⁻或S⁰，产生S²⁻，随即与Fe²⁺反应生成硫化亚铁（FeS）。

常规粒径FeS为黑色，FeS以纳米颗粒（nFeS）形态存在时，因散射效应呈现白色至灰白色。

黑色沉淀：随着时间推移，FeS颗粒会逐渐团聚，最终形成黑色的硫化亚铁（FeS）沉淀

代谢通路切换

电子受体优先级： 菌株优先利用还原势较高、能量效益较好的电子受体。当Fe³⁺还原的能量收益高于SO₄²⁻还原，铁呼吸被优先选用。

环境因素：
1. Fe³⁺浓度不够：传代后Fe³⁺浓度降低，作为电子受体匮乏；
2. Fe²⁺累积：抑制铁还原相关酶的表达；
3. 硫源持续存在（如半胱氨酸、九水硫化钠、MgSO₄等），为硫还原提供底物；
4. 氧化还原电位持续降低至，适合硫还原的负电位区域；
5. 基因表达水平的适应性进化，使硫还原模式成为优势。

G. sulfurreducens 在铁和硫共存时可进行“协同还原”。初始pH升高（传代中常因代谢产物累积而上升）或Fe/S比例降低，会加速向硫化物状态转变。

此外，FeS纳米颗粒附着于菌体表面可保护细胞免受重金属毒性，此自我保护机制可能在传代中被选择性保留。

硫还原地杆菌代谢通路

3 验证方案

4 结果分析与结论

实验分析，红褐色沉淀向白色沉淀转变的，可能原因是：

铁还原通路因Fe³⁺消耗、Fe²⁺积累或基因表达下调而受阻，菌株转而启动硫还原代谢，生成纳米FeS白色沉淀 或 积累后的黑色沉淀。

该代谢转换是菌株对环境胁迫的适应性反应，符合前人报道的代谢灵活性。

两种沉淀的本质区别：

建议优先执行酸性刺激试验与补充新鲜Fe³⁺刺激实验，快速确认代谢切换假说；后续可根据条件选择XRD或SEM‑EDS最终确认。

5 硫还原地杆菌的代谢细节、培养要点及颜色表现原理

代谢方式细节

铁呼吸（Fe³⁺还原模式）
电子供体：醋酸盐或氢气；电子传递链：CbcL → PpcA → OmcB/OmcS等外膜细胞色素；终端受体：Fe³⁺（柠檬酸铁、FeOOH等）；能量收益较高。

硫呼吸（S⁰/SO₄²⁻还原模式）
电子供体相同；部分共享细胞色素，但下调OmcB等铁还原专用蛋白，上调硫酸盐还原酶（DsrAB）；终端受体：S⁰或SO₄²⁻，产物S²⁻；能量收益低于铁呼吸。

切换机制： 优先进行铁呼吸。触发条件包括Fe³⁺浓度<1 mM、Fe²⁺积累、pH升高、Eh下降至<‑200 mV。

培养要点

绝对严格厌氧： 使用80% N₂‑20% CO₂混合气除氧；添加L‑半胱氨酸盐酸盐（0.5‑1 g/L）和Na₂S·9H₂O（0.1‑0.3 g/L）作为还原剂；采用带丁基橡胶塞的厌氧血清瓶，注射器操作。

培养基配制关键： 推荐DSMZ Medium 826、DSMZ 579或ATCC Medium 1957。

DSMZ Medium 826：硫还原地杆菌培养基

NH₄Cl ......................................... 1.50 克

Na₂HPO₄ ..................................... 0.60 克

KCl ............................................ 0.10 克

Na-醋酸盐 ................................... 0.82 克

改良 Wolin 矿物质溶液 ................. 10.00 毫升

NaHCO₃ ...................................... 2.50 克

Na₂-富马酸盐 .............................. 8.00 克

Wolin 维生素溶液（10×） .............. 1.00 毫升

蒸馏水 ....................................... 1000.00 毫升

# 配制说明：溶解各成分（除碳酸氢盐、富马酸盐和维生素外），用 80% N₂ 和 20% CO₂ 的混合气体对培养基曝气 30–45 分钟，使其达到无氧状态。加入碳酸氢盐，并用相同混合气体平衡培养基，使 pH 达到 6.8，然后在相同气体气氛下将培养基分装至无氧 Hungate 型试管或血清瓶中，高压灭菌。灭菌后，从在 100% N₂ 气氛下制备并经过滤除菌的无氧储备液中加入富马酸盐和维生素。必要时检查并调整 pH 至 6.8。

改良 Wolin 矿物质溶液

次氮基三乙酸 ............................. 1.50 克

MgSO₄ × 7 H₂O .......................... 3.00 克

MnSO₄ × H₂O ............................ 0.50 克

NaCl ......................................... 1.00 克

FeSO₄ × 7 H₂O .......................... 0.10 克

CoSO₄ × 7 H₂O .......................... 0.18 克

CaCl₂ × 2 H₂O ........................... 0.10 克

ZnSO₄ × 7 H₂O .......................... 0.18 克

CuSO₄ × 5 H₂O .......................... 0.01 克

AlK(SO₄)₂ × 12 H₂O ................... 0.02 克

H₃BO₃ ...................................... 0.01 克

Na₂MoO₄ × 2 H₂O ...................... 0.01 克

NiCl₂ × 6 H₂O ........................... 0.03 克

Na₂SeO₃ × 5 H₂O ....................... 0.30 毫克

Na₂WO₄ × 2 H₂O ....................... 0.40 毫克

蒸馏水 ..................................... 1000.00 毫升

# 配制说明：首先溶解次氮基三乙酸，并用 KOH 调节 pH 至 6.5，然后加入矿物质。最后用 KOH 将 pH 调整至 7.0。

Wolin 维生素溶液（10×）

生物素 ...................................... 20.00 毫克

叶酸 ........................................ 20.00 毫克

盐酸吡哆醇 .............................. 100.00 毫克

盐酸硫胺素 .............................. 50.00 毫克

核黄素 .................................... 50.00 毫克

烟酸 ........................................ 50.00 毫克

D-(+)-泛酸钙 ............................ 50.00 毫克

维生素 B₁₂ ................................ 1.00 毫克

对氨基苯甲酸 ............................ 50.00 毫克

(DL)-α-硫辛酸 .......................... 50.00 毫克

蒸馏水 ..................................... 1000.00 毫升

DSMZ Medium 579：地杆菌培养基
最终 pH：6.7 – 7.0
最终体积：1011 毫升

柠檬酸铁（Aldrich F6129）................. 13.70 克
NH₄Cl ............................................... 1.50 克
NaH₂PO₄ ........................................... 0.60 克
KCl .................................................. 0.10 克
Na-醋酸盐 ......................................... 2.50 克
改良 Wolin 矿物质溶液 ....................... 10.00 毫升
NaHCO₃ ............................................ 2.50 克
Wolin 维生素溶液（10×） .................... 1.00 毫升
蒸馏水 ............................................. 1000.00 毫升

# 配制说明：首先将柠檬酸铁加热溶解于水中，并调节 pH 至 6.0，然后加入除碳酸氢盐和维生素外的其他培养基成分。用 80% N₂ 和 20% CO₂ 的混合气体对培养基曝气 30–45 分钟，使其达到无氧状态，然后加入并溶解碳酸氢盐，调节 pH 至 6.8。之后，在 80% N₂ 和 20% CO₂ 气体气氛下将培养基分装至无氧 Hungate 型试管或血清瓶中，高压灭菌。从在 100% N₂ 气氛下制备并经过滤除菌的无氧储备液中加入维生素。必要时将完全培养基的 pH 调整至 6.7–7.0。

1. 注意：使用 5–10%（体积比）的接种量。

改良 Wolin 矿物质溶液（来自培养基 141）

次氮基三乙酸 ............................. 1.50 克
MgSO₄ × 7 H₂O .......................... 3.00 克
MnSO₄ × H₂O ............................ 0.50 克
NaCl ......................................... 1.00 克
FeSO₄ × 7 H₂O .......................... 0.10 克
CoSO₄ × 7 H₂O .......................... 0.18 克
CaCl₂ × 2 H₂O ........................... 0.10 克
ZnSO₄ × 7 H₂O .......................... 0.18 克
CuSO₄ × 5 H₂O .......................... 0.01 克
AlK(SO₄)₂ × 12 H₂O ................... 0.02 克
H₃BO₃ ...................................... 0.01 克
Na₂MoO₄ × 2 H₂O ...................... 0.01 克
NiCl₂ × 6 H₂O ........................... 0.03 克
Na₂SeO₃ × 5 H₂O ....................... 0.30 毫克
Na₂WO₄ × 2 H₂O ....................... 0.40 毫克
蒸馏水 ..................................... 1000.00 毫升

配制说明：
首先溶解次氮基三乙酸，并用 KOH 调节 pH 至 6.5，然后加入矿物质。最后用 KOH 将 pH 调整至 7.0。

Wolin 维生素溶液（10×）（来自培养基 120）

生物素 ...................................... 20.00 毫克
叶酸 ........................................ 20.00 毫克
盐酸吡哆醇 .............................. 100.00 毫克
盐酸硫胺素 .............................. 50.00 毫克
核黄素 .................................... 50.00 毫克
烟酸 ........................................ 50.00 毫克
D-(+)-泛酸钙 ............................ 50.00 毫克
维生素 B₁₂ ................................ 1.00 毫克
对氨基苯甲酸 ............................ 50.00 毫克
(DL)-α-硫辛酸 .......................... 50.00 毫克
蒸馏水 ..................................... 1000.00 毫升

ATCC 培养基 1957：地杆菌培养基（Geobacter Medium）

基础成分：

氯化铵 (NH4Cl) ……………………………………… 1.5 克

磷酸二氢钠 (NaH2PO4) …………………………… 0.6 克

氯化钾 (KCl) ………………………………………… 0.1 克

碳酸氢钠 (NaHCO3) ………………………………… 2.5 克

乙酸钠 (Sodium acetate) ………………………… 0.82 克

沃尔夫氏维生素 (Wolfe's Vitamins, MD-VS) …… 10.0 毫升

沃尔夫氏金属元素 (Wolfe's Metals, MD-TMS) … 10.0 毫升

蒸馏水 ………………………………………………… 976.0 毫升

0.025% 刃天青溶液 (Resazurin, 见下方配制方法) … 4.0 毫升

制备说明：

请在 80% 氮气 (N2) 和 20% 二氧化碳 (CO2) 的厌氧环境下配制并分装该培养基。

培养基的最终 pH 值应约为 6.8。

在 121°C 下高压灭菌 15 分钟。

0.025% 刃天青溶液 (Resazurin) 配制方法：

刃天青 (Resazurin) ……………………………… 25.0 毫克

去离子水 (DI Water) …………………………… 100.0 毫升

富马酸盐溶液（需单独配制，见下方）：

请单独配制富马酸盐溶液，并向两支 16R 试管中各分装 10 毫升。

1M 富马酸钠溶液 (Sodium fumarate 1M solution)：

富马酸钠 (Sodium fumarate) …………………… 16.0 克

去离子水 (DI Water) …………………………… 100.0 毫升

使用建议：

日常维持与扩培：推荐使用 DSMZ 826（富马酸盐培养基）。生长快、体系均一、不易发生代谢漂移。先在826中恢复活力，再转接至579进行实验。

铁代谢实验：使用 DSMZ 579，新鲜配制柠檬酸铁溶液，避免长时间储存。采用 5-10% 的高接种量，缩短适应期。

若出现白色沉淀，按先前报告诊断：可能已切换至硫呼吸。

推荐交替使用两种培养基：每2-3次铁还原传代后，回到富马酸盐培养基（826）中“重置”代谢状态。冻存菌种时，采用在826中生长至对数中期的培养物，加入甘油后于-80°C保存。

菌液与沉淀颜色表现原因

正常红褐色： = 菌体色素（细胞色素c，红褐色） + 铁沉淀（蓝铁矿，蓝绿至浅褐色）的叠加。活跃呼吸时细胞色素处于还原态，菌体呈鲜红褐色；Fe²⁺与磷酸根结合形成蓝铁矿附着，使颜色更深更饱满。

异常白色沉淀： = 菌体褪色（铁还原专用细胞色素表达下降） + 新生白色FeS纳米沉淀。硫还原产生的S²⁻立即与Fe²⁺生成nFeS，因光散射呈白色。加稀盐酸释放H₂S臭味可区分。

其他可能颜色：黑色沉淀（大粒径FeS或Fe₃O₄）、绿色培养液（高浓度Fe²⁺水合离子）、无色澄清（菌体死亡或不生长）。

实验总结

硫还原地杆菌在长期传代中因Fe³⁺逐渐消耗且未及时补充，导致铁还原通路受阻；在硫源存在下启动硫还原呼吸，生成纳米FeS白色沉淀；

同时铁还原特有的细胞色素c表达下降，自身红褐色褪去。二者共同作用使培养物由红褐色完全转变为白色。

纠正措施：
1. 重新从原始冻干管或‑80°C甘油管活化菌株。
2. 使用新鲜配制的含铁培养基，确保Fe³⁺‑citrate浓度不低于50 mM，更换新鲜培养基。
3. 传代时离心洗涤菌体，以去除积累的Fe²⁺和硫化物。
4. 长期维持铁还原模式时，控制硫源底物浓度，如还原剂等，优先采用真空抽气和气体置换，去除培养基中的氧气。

参考文献

https://www.mun.ca/biology/scarr/Principle_of_RT-PCR.html

http://www.primerdesign.co.uk/assets/files/beginners_guide_to_real_time_pcr.pdf

https://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ_Medium579.pdf

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更新日期：2026-05-30

编制人：小藻

审稿人：