质粒、病毒载体构建服务
来源：灰藻科技 浏览量：1657 发布时间：2024-06-04 21:37:13
质粒载体和病毒载体是两种常用的基因传递工具，它们的结构、作用机制以及应用特点存在差异性。灰藻生物|微生物资源鉴定保藏平台，可为生命科学领域的科研工作者，提供专业、稳定、高效的载体设计及构建服务，涵盖普通真核表达载体和病毒载体等。
质粒载体
质粒载体服务
质粒是存于细菌、酵母菌和放线菌等微生物体内、染色体外的环状DNA分子，一般经人工改造用于基因传递相关操作。质粒作为基因工程的常用载体，可携带外源基因，通过物理或化学方法，进入宿主细胞。
质粒载体有其优势，如表达时间快，进入宿主细胞后，很短时间便可观察到目的基因表达；质粒载体的构建难度和构建成本均有优势。③过表达载体库和过表达标记丰富。
其局限性在于，转染试剂具有毒性，可能影响细胞活性；有些细胞转染难度大，达不到基因操作目的；质粒若不整合到基因组，只能进行瞬时表达，无法观察长周期实验。
灰藻生物可提供大量现货质粒：
质粒载体
质粒载体系列参照表
| 质粒系列 | 载体名称 |
|---|---|
| 哺乳细胞表达质粒 | pBudCE4.1，pCDNA，pCMV，pEnCMV，pCAGGS，plRES，pEF，pEGFP，pACGFP1，pDsRed2，pECFP，pEYFP，pmCherry，pBudCE4.1，pTracer-CMV2，pCAG，pML-EnCMV，pVAX1，pT3-EF1a，pTT5，pBK-CMV，pPGK，pENTR5-UbCp，pRC-CMV，pClG，pNTAP-B，pUB6-V5，pCAGIG，pDisplay，pAP3neo，pSG5，pTurbo，pEYFP，pCEP4，pEBB，pMaCTag，pBiT2.1，pXJ40，pHaloTag，pNeoEGFP，pLIVE，pDendra2-C，pCl，pRK ... |
| 转座表达质粒 | PiggyBac-TRE3GS，PiggyBac-CMV，PiggyBac-EFla，pSBbi-Hyg，pTol2，pT2，pSBtet-GP，pT4-CMV，pPB-CAG-emp-ty-pgk-hph，pPB-US-ECasE ... |
| 慢病毒质粒 | pLVX，pCDH，pHIV，pLVML，MCS，pLenti，pHAGE，pMLLV，pLV，pSIN，pFUIPW，pHR ... |
| 逆转录病毒质粒 | pRV-MMLV，pMSCV，PLEGFP，pRetroX，pMXs，PBABE，pLXSN，pLNCX2，pQCXIN，OpQCXIP，pCL-Eco，pHR ... |
| 腺病毒质粒 | pAdTrack，pDC316，pDC315，pShuttle，pADV ... |
| 腺相关病毒质粒 | pAAV，PAAV-CMV，pAAV-EnCMV，pAAV-EF1a，pAAV-hSyn，pMLAV，pSCAAV，pMLAAV，pMLAV ... |
病毒载体
当前流行的病毒载体，主要由4种病毒演变而来，即逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒AAV。其中，腺病毒和AAV以游离形式高效感染宿主细胞，进而表达所携带的外源基因，编码蛋白质，而逆转录病毒和慢病毒，则是直接将其整合到宿主细胞的基因组中。病毒载体不会杀死宿主细胞，可用于稳定转染哺乳动物细胞。
逆转录病毒
其中，逆转录病毒（也称反转录病毒），属于RNA病毒的一种。其两端是长末端重复序列（LTR），含有强启动子和增强子，能够让病毒基因组整合到宿主基因组中转录比较活跃的位点。通过人工操作，将LTR之间的序列替换成目的基因，便可在病毒感染过程中，将RNA经逆转录酶合成双链DNA，再经整合酶作用，整合至宿主细胞基因组，随宿主细胞分裂传递给子代细胞，在细胞内稳定地表达，达成实验目的。
病毒载体
一般来说，逆转录病毒至少包含3个基因：
gag基因：编码Gag聚合蛋白，最终被剪切成为病毒基质、衣壳和核衣壳蛋白
pol基因：编码蛋白酶、反转录酶核整合酶，这部分也是逆转录病毒的核心
env基因：编码聚合蛋白，会被病毒蛋白酶剪切成表面糖蛋白gp70和跨膜蛋白p15E，也就是包膜 (包膜蛋白决定了感染细胞的类型)。
慢病毒载体
基于人I型免疫缺陷病毒（HIV-1）改造的慢病毒，是实验室中使用较为广泛的病毒载体，慢病毒虽然也属于逆转录病毒，但远比一般逆转录病毒复杂，除了3个基本编码结构，至少还会编码6个调节基因（tat、rev、vpr、vpu、nef和vif）。其中，tat和rev负责转录和翻译，vif、vpr、vpu和nef负责病毒包装。
病毒载体
慢病毒优势：
慢病毒载体可容纳大片段（4kb）外源基因；
慢病毒可将目的基因正和岛宿主细胞的基因组，实现长期稳定的高效表达；
慢病毒可稳定整合到分裂和非分裂细胞基因组，对一些转染难度高的细胞，如原代细胞、干细胞和神经细胞等具有良好的感染效率；
慢病毒免疫原性低，直接注射活体组织不易造成免疫反应，可用于活体动物实验
慢病毒基因毒性比逆转录病毒低得多，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗，不会造成二次感染，使用相对安全；
病毒载体
| 表达系统 | 基因特性 | 外源基因表达时间 | 片段大小 | 稳定细胞株筛选 | 细胞实验 | 动物实验 | 滴度范围 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 真核表达载体 | 双链DNA质粒 | 24h开始表达，持续3-7天 | 8kb左右 | 难操作 | 细胞系，部分转染效率低 | 不适合 | 无 |
| 慢病毒载体 | RNA逆转录病毒 | 2-4天开始表达，长时间稳定表达 | 4kb左右 | 可以 | 首选，广谱，感染效率高 | 适合，根据观察时间和注射部位 | 10^8~10^9 TU/ml |
| 重组腺相关病毒载体 | 单链DNA病毒 | 7-14天开始表达 | 2.8kb左右 | 不可以 | 不适合 | 首选，根据观察时间和注射部位 | 10^12-10^13 vg/ml |
| 重组腺病毒载体 | 双链DNA病毒 | 1-2天开始表达 | 6kb左右 | 不可以，瞬时表达 | 广谱，感染效率高 | 免疫原性高，慎选 | 10^10-10^11 pfu/ml |
病毒载体构建服务内容
基因过表达载体构建、基因定点突变表达载体构建、用于基因沉默的shRNA设计与构建、microRNA表达与封闭载体设计与构建、萤光素酶报告基因载体构建（UTR、启动子及其它功能序列）以及Cre-LoxP系统和CRISPR/Cas9基因编辑工具载体设计与构建等。
| 服务内容 | 周期 | 交付内容 |
|---|---|---|
| 基因表达慢病毒 | 4-6周 | 1x108TU浓缩慢病毒 |
| 基因干扰慢病毒 | 4-6周 | 1x108TU浓缩慢病毒 |
| 基因敲除慢病毒 | 4-6周 | 1x108TU浓缩慢病毒 |
载体构建基本步骤：
目的DNA片段和载体的制备；目的DNA片段和载体的连接；连接产物的转化；克隆筛选；测序验证及结果交付
提供信息
模板完整序列，包括目的DNA序列和载体序列，酶切位点、模板质粒、目的质粒的名称、抗性等信息；定点突变的具体要求，以及突变后的目的序列；建议客户提供含有目的基因的质粒作为模板。
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— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上
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