菌株（细菌/真菌/古菌）鉴定服务

菌株鉴定介绍

菌株鉴定是指通过各种实验方法，确定微生物具体分类的过程，本服务主要是指基于DNA测序的分子生物学鉴定实验手段。微生物菌种DNA测序鉴定是一种利用DNA测序技术对微生物的物种进行准确识别的方法。它不依赖于微生物的形态、生理、生化等特征，而是通过分析微生物的核糖体RNA基因（rDNA）的序列，与数据库中的已知序列进行比对，从而确定微生物的生物学分类。微生物菌种DNA测序鉴定比传统的生化鉴定方法更快速、更准确、更全面，可以应用于医学、农业、环境、工业、食品等领域的微生物多样性分析。

Sanger测序技术

16S rDNA测序

16S rDNA测序技术是针对细菌和古细菌的一种鉴定方法，它利用16S rRNA基因的高变区作为标记，进行微生物的分类和鉴定。16S rDNA的长度约为1540个碱基对，大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中常用、有用的“分子钟”，也被称为“细菌化石”，存在于所有原核生物的染色体基因组中。

16S rRNA基因既有恒定区（constant region），也有可变区（variable region），保守区反映了微生物的亲缘关系，可变区反映了微生物的差异。不同的高变区有不同的特异性和覆盖度，一般选择V3-V4区或V4-V5区进行测序。通过对16S rDNA进行PCR扩增和测序，可以获得原核生物的16S rRNA的序列信息，然后与数据库中的已知序列进行比对，从而确定原核生物的种类和相对丰度，目前被广泛用于医学、农业、环境等领域 。

18S rDNA测序

18S rDNA测序技术是针对真菌的一种方法，它利用18S rRNA基因的高变区作为标记，进行微生物的分类和鉴定。18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，存在于所有真核生物的基因组中。

18S rRNA基因也有保守区和可变区，保守区反映了生物物种间的亲缘关系，可变区反映了物种间的差异。一般选择V4区或V9区进行测序，因为这些区域的特异性好，数据库信息全，分类效果好。18S rDNA测序技术可以鉴定出样本中的真核微生物的种类和相对丰度，目前被广泛用于水生生物、土壤生物、人体微生物等领域。

ITS测序

ITS测序是针对真菌的另一种方法，它利用内转录间隔区（Internally Transcribed Spacer，ITS）作为标记，进行微生物的分类和鉴定。ITS是位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间的非编码区，分别为ITS1和ITS2。

ITS由于承受较小的自然选择压力，在进化过程中能够容忍更多的变异，表现出极为广泛的序列多态性。ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。ITS序列片段较小（ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。

实验流程

菌株分子生物学鉴定的具体步骤如下：

• 样本准备：从新鲜培养物中挑选单一样本，通常是纯化菌落，清洗菌落以去除可能的污染；
• DNA提取：将菌落或菌液转移至离心管，使用试剂盒提取DNA，纯化DNA，检测DNA质量和浓度；
• PCR扩增：针对目标基因选择特异性引物，如16S rRNA（细菌/古菌）或18S rRNA/ITS区域（真菌），准备PCR反应体系（模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液等），在热循环PCR仪上进行扩增（预变性、循环变性、退火和延伸等）；
• PCR产物纯化：对PCR产物进行纯化，去除未结合引物、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和其他小分子杂质，常用凝胶电泳；
• DNA测序：将纯化的PCR产物，送入测序仪进行测序，常用Sanger测序技术；
• 序列分析：对序列数据进行质控、拼接和编辑，得到的完整rDNA序列，将其与NCBI的GenBank、EzBiocloud或其他微生物序列数据库进行比对，序列同源性统计分析；
• 鉴定报告：鉴定服务周期为2-4周，一般来说霉菌的鉴定周期较长，报告内容包括实验方法、测序结果、比对分析等。
• 
• 实验流程

根据序列比对结果，按照相似度高低判断种属：

当相似度在99%以上，可判定二者种属相同；

当相似度在97%以上,可判定二者的属相同；

当相似度在95%以上，可判定二者的科相同。

信息登记

• 拉丁名称：以最新分类学名称为准
• 中文名称：广泛传播的中文名称
• 原始编号：
• 保藏编号：
• 生物安全等级：1级/2级/3级/4级
• 培养特性：营养需求，推荐培养基，最佳温度，培养时间等
• 需氧类型：专性好氧/兼性厌氧/微好氧/严格厌氧
• 备注说明：

送样要求

• 1、若寄送菌株样本，推荐低温运输以确保活性。建议纯化三次以上，确保平板和斜面为单一菌落；
• 2、请尽早向技术说明培养条件，若菌株对培养基有特殊要求，建议同时寄送适量培养基；
• 3、若寄送菌液形式样品，确保菌液浓度足够，离心后的菌体质量不少于0.5g；
• 4、若寄送菌株DNA样品，确保DNA浓度不低于10ng/μl，DNA总量不少于50μl；
• 5、若样品纯度或浓度不满足要求，进而导致测序结果不佳（如测序套峰），公司不承担相关责任；
• 6、革兰氏阳性菌细胞壁较厚，采用试剂盒常规方法较难破壁，建议直接提供DNA样品，减少测序周期；
• 7、实验室目前仅接受低风险样品（生物安全等级2级以下），安全等级2级以上微生物，请提供灭菌处理的DNA样品；
• 8、其它服务细节，请联系客服咨询。

常见问题

• Q：测序结果存在套峰的原因有哪些？
• A：在测序反应中，模板或引物异常都可能造成套峰现象，主要原因有以下几点：测序引物在模板上有两个结合位点形成套峰；模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆，如果是PCR,原因为非特异性条带；模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等。其中，菌株不纯导致的套峰仍正常收费。
• Q：为什么测序结果找不到引物序列？
• A：如果是PCR样品，在测序报告上找不到引物序列是正常的。因为测序反应是通过对被荧光标记的ddNTP的读取而获得基因序列的，测序引物没有荧光标记，因此在测序结果中不会被识别。实际上不仅测序引物无法识别，受限于当前的测序技术，紧靠测序引物一侧的30～50个bp通常也无法确保识别。质粒或菌株样品使用通用引物测序，可能是因为PCR引物距离载体的通用引物位点过近，由于测序反应在距离起始位点30-50bp内的结果可信度不高，影响了正确读取PCR引物序列。>

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— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

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2024.05.24