微生物培养过程中如何避免杂菌，常用的灭菌方法有哪些？

灭菌是指通过特定工艺，消除材料或培养基中存活微生物的过程。灭菌与消毒、清洁、巴氏杀菌及抗菌处理等概念有区分，后者仅能针对部分微生物。消毒是指杀灭或清除传播媒介上的病原微生物，使之达到无害化的处理。根据有无已知的传染源可分预防性消毒和疫源性消毒；根据消毒的时间可分为随时消毒和终末消毒。灭菌可通过热力、化学、辐射或过滤等方法实现。

灭菌体系

加热灭菌

热力灭菌的主要方法包括

1）湿热（饱和蒸汽）灭菌

2）干热（热空气）灭菌

热量通过使蛋白质变性和凝固来杀灭微生物。湿热灭菌相比干热灭菌具有速度更快、所需温度更低的优势。湿热灭菌是培养基灭菌最常用的方法，若正确使用，它是一种经济、安全且可靠的灭菌方式。

湿热灭菌

水在100°C时沸腾，但要在合理时间内，杀灭具有抗性的细菌孢子，则需要更高温度。121°C维持15分钟是被广泛认可的灭菌标准条件，适用于不超过1.0L的培养基灭菌。

"121°C高压灭菌15分钟"的定义是指，容器内物品保持在121°C达15分钟，而非灭菌器设定的温度和时间。在此温度下，蒸汽压力有助于热量渗透至待灭菌物品内部。若需对更大容量的单一容器进行灭菌，则应延长灭菌时间。多项因素会影响灭菌效果，包括灭菌物品的体积与内容物特性、干燥及冷却时间等。

某些成分可能在较高温度和较长灭菌周期下发生分解，因此必须对所有灭菌程序，进行严格验证以确保有效性。

灭菌工艺验证与认证的基本原则，包括以下要点：

1. 确认处理设备，具备在设定参数范围内运行的能力；

2. 验证关键控制设备及仪器，可在工艺要求参数范围内正常运行；

3. 使用实际产品或模拟产品进行重复工艺验证：确保所有操作均在规定规程范围内完成，最终验证微生物存活概率不超过规定限值；

4. 日常运行中持续监控已验证工艺，并定期进行设备再确认与再认证；

5. 完整记录上述验证过程的所有规程与步骤。

注：有关工艺验证的完整说明，请参考相关专业文献。

确保温度记录准确至关重要，必须使温度达到待灭菌物品的所有部位并维持所需时长。灭菌腔室需使用记录式温度计进行监测，同时可在物品内部埋设热电偶进行温度测量。

湿热灭菌：立式灭菌器

为确保培养基灭菌效果最佳，需用非脱脂棉或透气盖，对液体试管及烧瓶进行松塞处理。试管应置于专用支架或松散摆放在灭菌篮内，烧瓶盛装液体不得超过其容积的三分之二。灭菌操作时需注意：装载量不得超过高压灭菌腔室容量，物品摆放须确保蒸汽可自由循环。液体灭菌完成后必须缓慢降压至常压状态，待溶液温度降至常压沸点以下方可开启舱门，此举可有效防止液体暴沸现象发生。

在高压灭菌器运行过程中，必须将灭菌腔室内的空气完全排出，并由蒸汽替代，否则会出现"热点"和"冷点"现象。下表显示了正确操作的高压灭菌器的压力-温度对应关系。

过度灭菌或长时间加热会改变培养基的成分。例如，碳水化合物在过热情况下会发生分解。过度灭菌培养基可能导致诸多问题，包括：

• pH值异常

• 琼脂凝胶强度下降

• 产生非典型沉淀物

• 培养基焦糖化或颜色加深

• 营养成分流失

• 选择/鉴别特性丧失

某些培养基（如Hektoen肠道琼脂和紫红胆盐琼脂）不可采用高压灭菌。配制此类培养基时，需加热至完全沸腾溶解。必须严格遵守每种培养基标签标注的配制说明。培养基添加剂应预先灭菌，并在无菌条件下添加到已灭菌的培养基中，添加温度通常控制在45-55°C为宜。

干热灭菌

干热灭菌法适用于以下材料：可能被湿热腐蚀的金属器械、粉末、软膏以及蒸汽难以穿透的致密材料。由于干热灭菌需要比湿热灭菌更高的温度和更长的时间才能达到效果，因此该方法仅限于培养基等不耐高温物品以外的材料。干热灭菌的标准条件为160°C下维持120分钟。

化学灭菌

化学灭菌法采用气态和液态灭菌剂，对特定医疗及工业器械进行灭菌处理。常用灭菌气体，包括环氧乙烷、甲醛和β-丙内酯；液态灭菌剂，则包含戊二醛、过氧化氢、过氧乙酸、二氧化氯及甲醛等。由于化学灭菌会影响培养基性能，故不适用于培养基制备。如需深入了解该主题，请参阅相关专业文献。

辐射灭菌

辐射灭菌是热敏感材料的可选处理方法，主要包括紫外线和电离两种方式。

紫外线具有化学活性，能够激发微生物细胞内原子（特别是核酸）的电子跃迁，从而产生致死性突变。这种作用会阻断微生物的繁殖能力。具有杀菌效力的紫外线波谱范围为240-280纳米。不同微生物对紫外线辐射的敏感性存在显著差异：黑曲霉孢子的抗性强度是枯草芽孢杆菌孢子的10倍，是金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的50倍，更是流感病毒的150倍。

由于大多数材料会强烈吸收紫外线，其穿透能力有限，因此紫外线灭菌仅适用于表面处理。相比之下，电离辐射（包括γ射线、高能X射线和高能电子束）产生的能量要高得多，可达紫外线能量的100倍至数百万倍。

电离辐射与紫外线不同，能深入穿透原子内部引起电子电离。其灭菌机制具有双重作用：既可直接作用于细胞DNA，也能通过产生的活性离子和自由基与DNA发生间接反应。

在灭菌应用领域，γ射线的使用频率高于X射线或高能电子束。γ射线由放射性同位素产生，其中钴-60是最常用的辐射源。采用γ射线灭菌需要持续数小时的辐照时间。γ辐照灭菌工艺的验证主要包括以下内容：

• 确认待灭菌物料的辐射兼容性；

• 确定产品装载方式并完成灭菌容器内的剂量分布测绘；

• 设定辐照时间参数；

• 验证所需灭菌剂量的准确投递。

辐射灭菌技术具有多重优势：化学反应活性低、可检测残留物极少，且过程控制变量少。γ射线辐照适用于多种热敏感产品的灭菌处理，这些产品同样可采用气体灭菌法，包括医疗器材与设备、药品、生物制品及实验室器具等。

过滤灭菌

过滤法是对液体和气体进行灭菌的有效方法，其原理是通过物理阻隔，而非灭活的方式去除微生物。主要采用两类过滤器：深层过滤器和膜式过滤器。

膜式过滤器通过筛分作用截留颗粒物，而深层过滤器则依靠吸附滞留作用。膜式过滤器的筛分效能主要取决于滤膜孔径尺寸，同时静电力作用也至关重要。平均孔径0.8μm的膜过滤器可截留小至0.05μm的颗粒物。细菌滤除通常采用0.2μm孔径，而病毒和支原体的截留则推荐使用0.01-0.1μm孔径范围。球菌和杆菌的直径约0.3-1μm，大多数病毒尺寸为0.02-0.1μm，部分病毒可达0.25μm。

过滤除菌

滤膜孔径的评级采用名义孔径标准，该标准反映滤膜截留特定菌株尺寸微生物的能力。灭菌级滤膜需满足以下要求：在≥30 psi压力下，每平方厘米膜表面能100%截留浓度达10⁷个/平方厘米的缺陷假单胞菌（Pseudomonas diminuta，ATCC™ 19146）培养物。此类滤膜的名义孔径额定为0.22μm或0.2μm。而细菌级滤膜（亦称分析级滤膜）仅能截留较大微生物，其名义孔径额定为0.45μm。

膜式过滤器在商业化制药生产中具有重要应用，主要用于热敏感药物溶液和注射剂的灭菌处理。该技术特别适用于细菌和病毒培养基所用血清的除菌过滤，以及受热易分解糖类溶液的灭菌。此外，膜过滤技术还被广泛应用于药品和医疗产品的无菌检测领域。

无菌保证

无菌保证度（Sterility Assurance）是指微生物在灭菌处理后仍存活的概率估值，通常以无菌保证水平（SAL，Sterility Assurance Level）或"灭菌程度"来衡量。在湿热灭菌验证中，采用含有耐热孢子的嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）作为生物指示剂，在121°C条件下进行灭菌效果验证。

测试灭菌剂

湿热（蒸汽）灭菌、干热灭菌、环氧乙烷灭菌及电离辐射灭菌均需通过生物指示剂进行验证。各类灭菌方法与其对应的标准生物指示剂如下：

在湿热灭菌过程中，可采用经特殊化学处理的试纸条作为温度指示手段，该试纸会在达到设定灭菌温度时发生颜色变化。

将嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus）的耐热孢子，与营养培养基及化学指示剂共同处理，并干燥于试纸条上。灭菌处理后，需对试纸条进行培养以观察孢子萌发生长情况，其颜色变化可直观显示灭菌效果（孢子是否被灭活）。根据规范要求，每个灭菌周期均应使用此类孢子试纸条进行验证。

术语表

生物负载（Bioburden）：指待灭菌产品或系统中初始存活的微生物种群数量

灭菌剂（Biocide）：能够杀灭微生物的化学或物理制剂

校准（Calibration）：通过对比测量设备与参照标准设备在特定量程内的输出结果，验证测量设备符合规定允差范围的过程

致死率（Death rate）：灭菌剂使微生物种群中具有繁殖能力的细胞数量下降的速率，通过处理前、中、后期取样并在培养基上进行活菌计数测定

D值（D value）：即十进制减少时间，指在特定温度下使微生物数量减少90%所需的处理时间（分钟）

微生物死亡（Microbial death）：微生物细胞在适宜繁殖条件下丧失代谢和繁殖能力的不可逆状态

工艺验证（Process validation）：通过文件化证据确认某工艺能达到预期效果的系统过程

无菌保证水平（Sterility Assurance Level，SAL）：经高压灭菌器处理后材料达到10⁻⁶微生物存活概率的公认标准，即灭菌物品中存在活微生物的概率低于百万分之一

灭菌工艺（Sterilization process）：使微生物存活概率低于10⁻⁶（百万分之一）的处理过程

热致死时间与热化学致死时间（Thermal Death Time & Thermal-Chemical Death Time）：在特定条件下，使用热力或热化学灭菌剂杀灭特定微生物种群所需的时间。典型的高耐热孢子热致死时间值为121℃蒸汽灭菌15分钟

参考文献

1. Block. 1992. Sterilization. Encyclopedia of microbiology, vol. 4. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

2. Cote and Gherna. 1994. In Gerhardt, Murray, Wood and Krieg (ed.), Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

3. The United States Pharmacopeial Convention, Inc. 2008. The United States pharmacopeia 31/The national formulary 26, Supp. 1, 8-1-08, online. United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md.

4. Perkins. 1969. Principles and methods of sterilization in health sciences, 2nd ed. Charles C. Thomas, Springfield, Ill.

5. Leahy. 1986. In Carleton and Agalloco (ed.), Validation of aseptic pharmaceutical processes. Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y.

6. Simko. 1986. In Carleton and Agalloco (ed.), Validation of aseptic pharmaceutical processes. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

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更新日期：2025-07-11

编制人：磊子    |    审稿人：小藻