细菌浓度测量：麦氏比浊法详解及其与OD600、平板计数法的比较与操作

引言

麦氏比浊法（McFarland Turbidity Standard）是一种用于微生物学中定量测定细菌悬液浓度的标准方法。该方法通过硫酸钡（BaSO₄）悬液的浊度来模拟细菌悬液的浓度，从而间接估计细菌数量。麦氏比浊法广泛应用于临床微生物学、药敏试验（如Kirby-Bauer法）、疫苗制备及分子生物学实验中的细菌标准化培养。

一. 麦氏比浊法的原理及操作步骤

麦氏比浊法的核心原理是浊度与细菌浓度成正比。由不同比例的1%硫酸（H₂SO₄）和1.175%氯化钡（BaCl₂·2H₂O）反应生成硫酸钡沉淀，形成稳定的悬浊液。其浊度与特定浓度的细菌悬液（通常为1.5×10⁸ CFU/mL）相匹配，从而用于校准待测菌液的浓度。

标准麦氏比浊管通常分为0.5~4.0麦氏单位（McFarland Unit），不同数值对应不同的细菌浓度（见表1）。

表1 麦氏比浊法与细菌近似浓度

（一）标准比浊管的配制

麦氏比浊管可通过商业购买或实验室自行配制，配制方法如下：

（注：麦氏比浊标准管，推荐直接采购市场上的成品耗材，价格不高）

表2 麦氏比浊标准管

1.按比例混合1% BaCl₂和1% H₂SO₄于比色管中。

2.剧烈震荡混匀，形成稳定的硫酸钡悬浊液。

3. 储存于避光、密封条件下，有效期通常为6个月（长期存放可能沉淀，需重新混匀）。

（二）细菌悬液比浊测定

1.制备细菌悬液：取新鲜培养的菌落，用无菌生理盐水或肉汤培养基制成悬液。

2.比浊对照：将菌液与标准麦氏比浊管（如0.5麦氏单位）并列，在均匀光源（如比浊仪或白纸背景）下观察浊度。

3.调整浓度：

若菌液过浓，用生理盐水稀释。

若菌液过稀，离心后重悬或延长培养时间。

4.验证浓度（可选）：

平板计数法：稀释菌液后涂布平板，培养后计算CFU。

分光光度法：测定OD₆₀₀值（通常0.5麦氏单位≈OD₆₀₀ 0.08~0.1）。

二. 麦氏比浊法的应用

1.药敏试验（Kirby-Bauer法）

调整菌液至0.5麦氏单位（≈1.5×10⁸ CFU/mL），确保药敏纸片扩散试验的准确性。

2.细菌接种标准化

在自动化血培养系统或PCR前处理中，需使用标准浊度的菌液以保证实验重复性。

3.疫苗和抗原制备

疫苗生产时需控制细菌浓度，麦氏比浊法可快速估算抗原量。

三. 麦氏比浊法的优缺点

1.优点

操作简便：无需复杂设备，适合基层实验室。

成本低：比浊管可长期保存，试剂廉价。

快速估算：适用于大批量样本的初步标准化。

2.局限性

精度较低：受主观视觉判断影响

适用于悬浮菌：不适用于沉淀或聚集的细菌（如链球菌、放线菌、链霉菌、诺卡氏菌属、丝状真菌等），事实上最广泛的应用场景是，肠道菌群中的各种细菌。

无法区分活菌/死菌：需结合平板计数法验证。

四. 麦氏比浊法的注意事项

比浊管需避光保存，防止硫酸钡沉淀。

菌液需充分混匀，避免细菌聚集影响浊度。

不同菌种差异：革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）比阴性菌（如大肠杆菌）更易聚集，需额外均质化处理。

校准仪器：若使用分光光度计，需定期用标准比浊管校准。

五. 麦氏比浊法、分光光度法（OD600）与平板计数法的比较与操作详解

（一）分光光度法（OD600）与麦氏比浊法、平板计数法的关系

这三种方法均用于测定微生物悬液的浓度，但原理、精度和应用场景不同：

表3 麦氏比浊法和平板计数法

联系与区别：

麦氏比浊法和OD600均为间接测量，依赖浊度或吸光度，无法区分活菌/死菌。

平板计数法是直接计数活菌的金标准，但耗时较长。

OD600通常需要麦氏比浊法初步校准，而平板计数法可用于验证前两者的准确性。

（二）分光光度法（OD600）详解

1.原理

细菌悬液在600 nm波长下对光的散射和吸收与菌液浓度成正比。

OD600=1.0， 通常对应 1×10⁹ CFU/mL（因菌种而异，需校准）。

2.操作步骤

①空白调零：用培养基或生理盐水作为空白，设定分光光度计OD600归零。

②测定样本：取均匀菌液放入比色皿，测定OD600值（避免气泡干扰）。

③浓度计算：

通过标准曲线（OD600 vs CFU）换算浓度。

若无标准曲线，可参考经验值（如大肠杆菌OD600=0.1，近似浓度 ≈ 1×10⁸ CFU/mL）。

3.注意事项

线性范围：OD600通常仅在0.2~0.8之间呈线性，过高需稀释。

菌种差异：不同细菌大小/形状影响OD值（如球菌OD值通常高于杆菌）。

干扰因素：培养基颜色、颗粒杂质需离心去除。

（三）平板计数法（CFU计数）详解

1.原理

通过梯度稀释菌液，涂布于固体平板，培养后计数单菌落（CFU），计算原液浓度。

2.操作步骤

梯度稀释：取100 μL菌液加入900 μL无菌生理盐水（10⁻¹稀释），依次稀释至10⁻⁶~10⁻⁸。

涂布平板：取100 μL适宜稀释度菌液涂布于琼脂平板，每个稀释度做3个重复。

培养计数：倒置平板于37℃培养18-24 h，选择30~300 CFU的平板计数。

浓度计算：CFU/mL=平均菌落数×稀释倍数×10

注：（×10因涂布量为100 μL，换算为1 mL）。

3.注意事项

均质化：菌液需涡旋混匀，避免细菌聚集。

选择合适稀释度：过高稀释度导致无菌落，过低则菌落重叠。

厌氧菌/特殊菌：需特定培养条件（如CO₂培养箱、三气培养箱、厌氧培养箱）。

4.常见问题解答Q&A

Q1：OD600能否直接换算CFU？

• 一般不建议直接换算，通过平板计数建立标准曲线，或者对该菌的浓度特性已经十分了解。不同菌种/培养基OD-CFU关系不同，直接换算容易产生较大误差。

Q2：麦氏比浊法为何用硫酸钡而非细菌本身？

• 硫酸钡悬液稳定，可长期保存，而细菌悬液易沉降或增殖。建议测量菌液麦氏浊度时，测量混匀时的瞬时值，而非静置后的数值。

Q3：平板计数为何选择30~300 CFU的平板？

• 小于30 统计误差大，大于 300 菌落重叠导致计数不准（“菌落拥挤效应”）。

总结

麦氏比浊法是一种经典的细菌浓度估算方法，尽管存在一定误差，但其简便性和低成本使其在微生物学实验中仍被广泛使用。结合分光光度法或平板计数法可进一步提高准确性，适用于科研、临床及工业微生物培养的标准化需求。

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更新日期：2025-05-16

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编制人：冬冬       |    审稿人：小藻