血琼脂：微生物学中的关键培养基——原理、应用与局限

引言

在微生物学领域，血琼脂作为一款关键的营养培养基，以其独特的配方和功能，支撑着临床诊断和科学研究中对微生物的深入探索。通过在基础培养基中添加哺乳动物血液，血琼脂不仅为苛养微生物提供了必要的营养，而且通过观察溶血现象，成为了细菌鉴定的重要工具。本文旨在全面解析血琼脂的构成、工作原理、制备方法、结果解读及其在医学和科研领域的应用，同时也揭示了它的局限性，为微生物学研究者和临床实验室提供一份详实的指南。

什么是血琼脂？

血琼脂是一种营养丰富的培养基，通过在基础培养基（如哥伦比亚琼脂或胰蛋白胨大豆琼脂）中补充血液来制备。这种培养基含有多种营养成分，特别适合那些对营养要求苛刻、在普通培养基如营养琼脂上生长不良的细菌。

血琼脂的制备通常需要加入大约5%的脱纤维哺乳动物血液（如人、羊或马血），并经过高压灭菌。它能支持苛养菌的生长，同时抑制某些细菌如奈瑟氏菌和嗜血杆菌的生长。为了使这些细菌能够生长，可以通过加热血琼脂来失活血液中的抑制因子，从而得到巧克力琼脂，这是一种支持奈瑟氏菌和嗜血杆菌生长的培养基。

血琼脂的一个重要用途是观察细菌生长引起的溶血现象，这有助于细菌的鉴定。血琼脂主要用于培养能够产生导致血液溶血的胞外酶的病原体。通过观察溶血反应的不同类型（α溶血、β溶血或γ溶血），可以辅助细菌的识别和分类。

血琼脂的组成

血琼脂，如同大多数营养培养基一样，包含一种或多种蛋白质来源、盐分以及牛肉浸出物以提供维生素和矿物质。除了这些基本成分外，还会添加5%的无纤维哺乳动物血液。哥伦比亚血琼脂和胰蛋白胨大豆血琼脂成分如下：

1、哥伦比亚血琼脂培养基

称取上述成分，加热溶解于 1000ml 蒸馏水中，分装三角瓶 121℃高压灭菌 15 分钟，冷至 50℃左右时，加入5%的无菌脱纤维羊血，混匀，倾入无菌平皿。注：培养基中含少量淀粉，若灭菌前未加热煮沸溶解，灭菌后冷却可能出现少量白色沉淀。

2、胰蛋白胨大豆血琼脂培养基

称取上述成分，于1L蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟，水浴中冷却至45～50℃，毎100mL加入5～10mL无菌脱纤维羊血，轻轻混匀后倾注平板。

血琼脂的原理

血琼脂的工作原理基于其作为营养丰富培养基的能力，通过补充血液来支持苛养微生物的生长，或不加血液作为通用培养基使用。添加到基础培养基中的血液提供了额外的生长因子，这些因子对于苛养微生物的生长至关重要。

血液的作用还在于帮助观察不同细菌的溶血反应。溶血反应的类型取决于所使用的动物血液种类。例如，绵羊血常用于A群链球菌的检测，因为它能提供最佳的结果，但绵羊血缺乏吡啶核苷酸，因此不能支持嗜血杆菌的生长。相比之下，马血最适于嗜血杆菌的生长和溶血，甚至其溶血模式可能与绵羊血上的链球菌相似。

除了血液，蛋白胨和胰蛋白胨提供了细菌所需的碳源、氮源、氨基酸、维生素和矿物质。它们的水溶性使得细菌更容易吸收这些营养物质。氯化钠的添加是为了维持培养基的渗透平衡，并防止生长过程中pH值的变化。蒸馏水提供了一个溶解营养物质的介质，便于细菌吸收。琼脂作为固化剂，为微生物提供一个稳定的生长表面，允许观察菌落形态和计数。

在一些情况下，培养基中会加入酚酞磷酸盐，用于检测产生磷酸盐的葡萄球菌，同时加入盐和琼脂来评估表面污染情况。总体而言，血琼脂通过其丰富的营养成分和特定的观察指标，成为细菌学研究和临床诊断中不可或缺的工具。

血琼脂和溶血

溶血是指由于某些细菌种类产生的胞外酶导致血液中红细胞破裂的现象。这些细菌产生的胞外酶被称为溶血素，它们从菌落向外扩散，造成红细胞的完全或部分裂解。在血琼脂上可以观察到四种不同类型的溶血，每种类型都可以通过菌落周围出现的溶血区来识别。

1、α溶血（α-hemolysis）：α溶血表现为菌落周围出现绿色或灰褐色的变色区域，这是由于红细胞的部分裂解造成的。在α溶血过程中，细菌产生的过氧化氢（H2O2）将培养基中的红细胞内的血红蛋白转化为正铁血红蛋白。α溶血性物种有些属于人体正常菌群的一部分，而像肺炎链球菌这样的菌种则可引起肺炎等严重感染。

2、β溶血（β-hemolysis）：β溶血由在血琼脂上菌落下方及周围的清晰溶血区定义。这个透明区域是由于培养基中红细胞的完全裂解，血红蛋白被分解成无色产物所致。β溶血性细菌包括A群链球菌如化脓性链球菌（S. pyogenes）和B群链球菌如无乳链球菌（S. agalactiae），这两种菌都与人类严重的感染相关联。

3、γ溶血（gamma hemolysis）：γ溶血也称为非溶血，因为没有发生红细胞的裂解。因此，在菌落下方或周围不会观察到颜色变化或溶血区。例如脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）就是非溶血性的，或称γ溶血性。

4、α'溶血（alpha prime or wide zone alpha hemolysis）：α'溶血是指在细菌菌落旁边有一小圈完整的红细胞，而在完整红细胞区外围则是红细胞完全裂解的区域。这种溶血模式可能会被误认为是β溶血，因为菌落周围同样会出现透明区。然而，α'溶血和α溶血的区别在于溶血区的宽度和范围。

图1、溶血环

血琼脂的制备和和保存

血琼脂的制备过程如下：

1、准备培养基粉末加入到1000毫升的蒸馏水或去离子水中；

2、加热混合物至沸腾，确保培养基完全溶解；

3、使用高压灭菌器在15磅压力（约121°C）下进行15分钟的灭菌处理；

4、灭菌后，将培养基取出并冷却至40-45°C左右；

5、在无菌条件下，向培养基中加入5%体积比的无纤维化、无菌血液，充分混合；

6、在无菌环境中将混合后的培养基倒入无菌的培养皿中；

7、培养基凝固后，可将培养皿放置在较低温度设置的热空气烤箱中几分钟，以去除使用前可能存在的任何水分。

血琼脂的储存条件：

1、粉末形式的培养基应储存在10到30°C之间的干燥、密封容器内；

2、已配制的培养基应在20-30°C的环境下储存；

3、开封后，干燥的产品应妥善保存，瓶口紧密盖好，以防结块，因为培养基具有吸湿性，容易吸收空气中的水分；

4、装有培养基的容器应存放在干燥通风的地方，远离极端温度和火源；

5、产品应在标签上注明的有效期之前使用。

遵循正确的制备和储存步骤，可以确保血琼脂培养基的质量和效果。

血琼脂结果解读

在血琼脂上的结果解读主要涉及观察细菌的生长情况、菌落形态以及溶血类型。以下表格展示了几种重要的医学相关细菌在血琼脂培养基上的生长特征、菌落形态和溶血反应：

这些信息有助于在临床微生物学实验室中对细菌进行初步鉴定，特别是当结合其他生化测试和抗原检测时。通过观察血琼脂上菌落的特征和溶血反应，可以对许多病原体进行快速识别。

血琼脂的主要用途

1、培养与分离苛养微生物：血琼脂尤其适用于如奈瑟氏菌（Neisseria）和链球菌（Streptococcus）这类营养需求较高的细菌的培养与分离。

2、细菌溶血类型鉴别：通过观察细菌在血琼脂平板上生长时引起的溶血反应（α溶血、β溶血或γ溶血），可以区分不同的细菌种类。

3、检测产磷酸盐的葡萄球菌：向血琼脂中添加酚酞磷酸盐，可以用于检测能产生磷酸盐的葡萄球菌（Staphylococci）。

4、制备抗原：血琼脂常用于制备如伤寒沙门菌（Salmonella Typhi）的抗原，用于血清学试验和疫苗制备。

5、食品样品分析：血琼脂基础培养基被认为是食品样品分析的标准方法之一，用于检测食品中的微生物污染。

血琼脂因其丰富的营养成分和对某些细菌特有的溶血反应观察能力，在临床微生物学、食品微生物学、流行病学调查和科研实验中发挥着重要作用。通过血琼脂培养，不仅可以鉴定细菌种类，还能了解其致病性，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。

血琼脂的局限性

血琼脂作为一种常用的微生物培养基，尽管拥有许多优点，但也存在一定的局限性：

1、嗜血杆菌生长抑制：血琼脂上的嗜血杆菌（Haemophilus hemolyticus）生长受到抑制，这是因为培养基中存在抑制因子。这些抑制因子只有在添加血液后加热培养基（制成巧克力琼脂）才能被失活，从而支持嗜血杆菌的生长。

2、溶血模式受血液类型影响：细菌在血琼脂上的溶血模式可能根据所使用血液的类型而有所不同。例如，不同的哺乳动物血液（如兔血或马血）会对溶血反应产生影响，进而影响细菌的识别。

3、嗜血杆菌与链球菌生长相似性：在使用兔血或马血的血琼脂上，嗜血杆菌的生长模式可能类似于链球菌属的细菌，这可能会给鉴别带来困难，需要进一步的确认实验来区分这两种细菌。

鉴于这些限制，血琼脂的使用需要结合其他培养基和实验技术，以确保准确的微生物鉴定和诊断。例如，巧克力琼脂用于嗜血杆菌的培养，而选择性或鉴别性培养基用于排除其他微生物的干扰。此外，分子生物学技术如PCR和基因测序也可以作为辅助手段，提高微生物鉴定的准确性。

总结

血琼脂，作为微生物学研究的基石，凭借其丰富的营养成分和独特的溶血观察能力，极大地促进了病原体的培养与鉴定。它不仅适用于苛养微生物的生长，还能通过溶血反应辅助细菌分类，对临床诊断和疾病理解至关重要。然而，血琼脂也有其局限性，比如对嗜血杆菌生长的抑制以及溶血模式受血液类型的影响，这提示我们在使用时需辅以其他技术和培养基以获得更准确的结果。综上所述，血琼脂在微生物学领域扮演着不可替代的角色，其科学价值和应用前景值得我们持续关注和探索。

【相关资源】

名称：哥伦比亚血琼脂即用型平板

菌株编号：HZB875001

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更新日期：2024-07-16

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