质粒载体的克隆

从理论上讲，用质粒载体进行克隆是十分简单的。闭环质粒被一种或几种限制性内切核酸酶切割后与具有相匹配的末端外源DNA在体外连接，连接反应的产物即可用于转化合适的E.coli菌株。然后通过PCR、杂交或限制性内切核酸酶消化选具有目的DNA 序列的克隆。

这些听起来很容易，然而要确保克隆实践的顺利成功，必须思熟虑!在拿起移液器之前，必须作出如下考虑:

选择适合手头工作目标的质粒载体

选择载体上的限制性内切核酸酶位点

用合适的连接反应条件

选用最适合扩增外源目的DNA的质粒的E.coli菌株具备筛选转化子的方法和验证目的基因克隆的技术

否需要特殊的步骤以降低转化菌落的背景(含“空”的亲本质粒)

在每一阶段都需要设置阴性及阳性对照在以上材料准备就绪后，下一步要制定一个周密的计划，以使片段、质粒、感受态细胞和探针等制备工作能够在程序和时间上有条不紊地进行。多数情况下，用质粒载体产生一个特定的重组子有几种不同的途径。但准备一个补救措施仍很重要，以防万一在执行原计划过程中出现难以预料的困难。

克隆带凸出末端的DNA片段

最容易克隆的是具有5或3凸出末端的DNA片段。识别序列内部不对称的限制性内切核酸酶消化载体和目的DNA很容易产生这些长1~6bp的单链末端(请参见图 1-2)。当 DNA 片段和载体的凸出末端相互匹配时，二者就能复性形成一个线状杂交分子，它们通过凸出未端的碱基间的互补配对连接在一起。因此，经如下的两步反应形成可以转化大肠杆菌的环状重组质粒(见图1-3):

线状质粒和插入 DNA之间的分子间反应，产生非共价结合的线状杂交分子

在分子内的反应中，线状杂交产物的凸出末端结合在一起形成非共价键结合的环状重组分子

复性使载体和目的 DNA 片段上的5'-磷酸基和 3'-羟基紧密接触，这样 DNA 连接酶能够催化两分子间形成磷酸二醋键。

环状单体质粒可以使外源 DNA片段以两种方向插入(见图1-4)。故单环重组质粒只互补凸出末端DNA分子间连接反应众多潜在产物中的一种。其他非重组产物包括各种大小、方向和组成的线状或环状的同源或异源多聚体。为了提高环状单倍重组子的比例，连接反应必须仔细设计，这并非轻而易举。第一步分子间的反应需要高浓度的DNA;而第二步分子内反应在DNA浓度低时效率更高。一般地，在DNA的总浓度小于10μg/m(Berlovich etal.1992)的情况下，以等摩尔量的质粒和目的DNA 间的连接反应通常能够得到可接受的单倍环状重组子产量。有关这一现象的讨论请见Sambrook等的文献(1989)。当质粒载体和目的DNA的摩尔比不正确时，连接反应会导致出现令人不快的高比率的空质粒(没有任何插入片段)或外源DNA片段的串联插入。在每个重组克隆中，插入DNA片段的数目必须通过限制性内切核酸图谱或其他方法验证，外源 DNA的插入方向也必须确定。

定向克隆

以上我们讨论了具有相同 DNA末端的连接反应，也就是把质粒和外源DNA以相同的单一限制性内切核酸酶处理后所进行的连接反应。一种增加环状单倍重组质粒的方法是:应用不同末端的连接反应策略，就是把外源DNA片段用不同识别位点的两种限制酶消化。在这种情况下，外源DNA的两个末端并不互补，彼此不能相互连接。因此，外源 DNA就会如愿地与用同样两种酶处理过的质粒载体相互连接，形成高比例目含预定方向的单倍环状重组质粒。这一过程称为强制连接或定向克隆(见图1-5)。

克隆平末端DNA片段

具有平末端的外源 DNA 片段可以克隆到带有平末端的线状质粒载体中(见图1-6)。平末端的连接反应是一种相对低效的反应。以下是克隆平末端DNA片段的合适反应条件(Sgaramella and Khorana 1972;Sgaranella and Ehrlich 1978)

低浓度(0.5 mmol/L)的ATP

无多胺(如亚精胺)存在

极高浓度的连接酶(50Weiss单位/ml)

高浓度的平末端

最后一个条件是成功的关键。在高浓度下，平末端DNA分子形成丰富而短暂的连接，使5'-磷酸基和 3'-羟基之间紧密接触。DNA 连接酶捕提到这种短暂的亚状态，并在不同分子基团间形成永久的磷酸二酯键。线状共价杂交的产物可以通过平末端间的分子内连接反应形成可以用于转化大肠杆菌的环状重组质粒。在理论上，第一步反应要求高浓度的 DNA，而第二步反应在DNA浓度较低时更有效。一些研究者因此提出第一步反应在高浓度 DNA下进行，经温育1h后，反应体系用连接缓冲液稀释20倍，再加入新的连接酶后继续温育4h(Bercovich et al.1992;Damak and Bullock 1993)。

在DNA量不足时，可通过向反应体系中加入促进大分子聚合的物质[如5%聚Z8000(PEG8000)](Pheiffer and Zimmerman 1983;Zimmerman and Pheiffer 1983;Upcroft and Healey 1987)或导致 DNA分子凝聚的物质(如 1.0 mmol/L 氯化六氨合高钴)(Rusche and Howard-Flander8 1985)来获得足够浓度的平末端。这种聚合和凝聚试剂可使平末端DNA的连接效率提高1~3个数量级,并促进分子间的连接反应,抑制分子内连接反应。

质粒载体的克隆基于少许几种常见的基本方法，均简单有效。方案17和19介绍了包括凸出末端和平末端的 DNA片段与质粒连接的基本技术。方案18、20、21和22介绍了获得合适重组质粒的各种优化策略。这些简单技巧的组合使质粒重组这一技术变得复杂而美妙。

参考文献

（美）J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔，分子克隆实验指南（第三版）（上册），科学出版社

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更新日期：2024-06-26

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编制人：木木