实验指南 | 空肠弯曲菌在小鼠模型中的毒力变化与定植研究

一、实验目的

本实验旨在探究空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni, Cj）在小鼠消化道环境中的适应性及其毒力变化规律，通过口服攻毒小鼠模型，观察细菌的定植、繁殖及毒力增强过程，为理解空肠弯曲菌导致的食源性胃肠炎以及相关自身免疫性疾病的发病机制提供实证依据。此外，本研究还旨在通过观察小鼠出现的腹泻、瘫痪等临床症状，建立一种模拟吉兰-巴雷综合征的动物模型，进一步深入研究空肠弯曲菌毒力增强菌株对小鼠周围神经系统的致病作用。

二、实验原理

空肠弯曲菌是一种常见的食源性人兽共患病原菌，主要通过未充分烹饪的肉类和未经灭菌的乳制品传播，其感染能引起人类急性胃肠炎，严重时可引发多系统性自身免疫疾病。该菌具有较强的环境适应性和基因多样性，能够利用鞭毛趋化穿过肠道黏膜，定植并繁殖，进而引发疾病。本研究通过模拟自然感染途径，利用小鼠模型观察空肠弯曲菌在消化道中的行为，包括定植、毒力变化及其对宿主的影响，尤其是对神经系统的影响，这有助于揭示空肠弯曲菌致病机制的关键环节。

三、实验材料

实验所用材料包括：实验菌株lulei株（来源于空肠弯曲菌菌株库）、多种培养基（如布氏肉汤培养基、哥伦比亚血琼脂平板等）、化学试剂（如磷酸盐缓冲液、马尿酸钠试剂、水合茚三酮试剂等）、以及一系列实验仪器（生物安全柜、电热恒温水浴锅、三气培养箱等）。同时，采用清洁级昆明小鼠作为实验动物，确保实验的标准化和可靠性。

四、实验过程

1、菌株复苏与培养

首先，从-80℃冰箱取出lulei株，经过-20℃和-4℃逐步解冻后，接入布氏肉汤培养基中，在微需氧条件下（5%O2、10%CO2、85%N2）42℃培养24小时，随后转接至含有7%无菌脱纤维羊血的哥伦比亚血平板中继续培养，以纯化菌株并制备菌悬液。

2、化学试剂与培养基制备

根据标准操作规程，配制布氏肉汤、哥伦比亚血琼脂平板、TBE缓冲液等，确保所有试剂与培养基无菌且符合实验要求。

3、菌株鉴定

通过革兰氏染色、马尿酸钠水解实验和多重PCR鉴定菌株，确保实验使用的为空肠弯曲菌lulei株。

4 、小鼠模型建立

筛选4周龄、9-12g的雄性昆明小鼠，随机分组，每组6只，进行不同批次的实验。通过口服灌胃方法，将菌悬液注入小鼠胃内，每批小鼠在灌胃后特定时间点（如24小时、7天、8天、9天）收集粪便，观察并记录小鼠的临床症状，如腹泻、瘫痪等，并进行粪便中空肠弯曲菌的分离培养。

5、分离培养与鉴定

从小鼠粪便中分离培养空肠弯曲菌，通过培养、鉴定后，观察不同时间点菌株的生长特性，如形态、运动能力及毒力变化。

6、菌株保存

将分离出的菌株使用甘油保存法长期保存，以供后续研究使用。

五、实验结果

实验结果显示，经口服攻毒后，空肠弯曲菌在小鼠消化道内成功定植并表现出毒力增强现象，部分小鼠出现腹泻和轻微的运动障碍，但未观察到明显的瘫痪症状。通过连续几代的菌株分离，发现随着时间的推移，部分菌株的毒力呈现出增加趋势，这体现在其粘附能力、定植效率及在小鼠体内引起的炎症反应上。此外，对分离菌株的形态学特征、生长速度及运动环直径的测量，进一步证实了毒力增强菌株的特征变化，为研究空肠弯曲菌毒力调控机制提供了直接证据。

综上所述，本研究通过一系列严谨的实验设计，不仅成功构建了空肠弯曲菌在小鼠消化道内定植和毒力变化的模型，而且初步揭示了毒力增强菌株与小鼠周围神经病变的关联，为后续深入探索空肠弯曲菌致病机制及开发相应防治策略奠定了坚实的基础。

【相关资源】

名称：空肠弯曲菌 | Campylobacter jejuni

菌株编号：HZB368924

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参考文献：

刘硕.空肠弯曲菌连续灌胃经小鼠消化道定植后分离及分离株毒力变化的研究[D].河北医科大学,2016.

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更新日期：2024-06-26

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编制人：冬冬