小鼠灌胃实验的通用操作教程（大鼠亦可参考）

引言

近年来微生物组的研究颠覆了人们对许多疾病的认知，已经证实肿瘤、消化、精神、代谢、心血管等多种疾病均与肠道菌群变化密切相关。肠道微生物是存在于动物消化道内的庞大且复杂的细菌群落，它们在宿主的健康和疾病状态中扮演着重要角色。

通过研究这些微生物，能够更好地理解饮食、药物以及环境因素如何影响宿主的生理过程，包括免疫反应、代谢功能以及神经系统的活动。

将单菌或菌群移植到小鼠体内，基于小鼠模型菌群移植的实验结果，评估特定微生物对宿主的影响，或者研究药物、营养物质等通过口服途径对生物体的作用。这类实验对于理解微生物与宿主之间的相互作用、开发新的治疗方法或疫苗具有重要意义，被广泛应用于研究人类疾病的动物模型中，如肥胖症、2型糖尿病、炎症性肠病等。

关键词：肠道微生物、小鼠灌胃、定量菌液、厌氧菌培养、培养基定制

肠道微生物小鼠灌胃

实验原理

微生物样品经过处理后，通过灌胃的方法，将微生物由小鼠口腔直接注入到小鼠胃中，使其在小鼠肠道定植，从而实现无菌小鼠肠道微生物移植，研究微生物在无菌小鼠的功能和作用机制等。

灌胃导管

材料与试剂

仪器设备

实验步骤

根据细菌的不同特性，选择合适的培养基，在特定温度和培养条件下培养。甘油冻存菌置37℃复苏10min后使用；冻干粉加入对应培养基后，置37℃复苏10min后使用。

一般细菌在培养后的8-10h达到对数期，用移液枪从对数生长期培养物中吸取1ml菌液于分光光度计样品池中，用紫外分光光度计检测OD600值(Optical Density) 确定菌液浓度。当OD600 ≈ 1时，菌液浓度约10^8-10^9 cfu/ml（麦氏比浊法亦可测定）。细菌原液以6000g离心5min后，去除上清重悬于无菌PBS中制成约10^8-10^9cfu/ml菌悬液。将该稀释菌液样本分装于灭菌离心管内密封，按照无菌传递要求将该样品传递进入隔离器内对动物进行灌胃。

取新鲜菌液进行微生物灌胃移植 (微生物的肠道定植受粪便采取方法、处理温度、空气暴露时间等影响较大，所以菌量只是影响定植的一个环节，一般不进行严格要求)，一般菌群的定植周期约为一周，单菌或特殊致病菌的定植周期为2-4周。可依据SPF级小鼠预实验结果调整灌胃剂量和周期。

粪菌移植前和粪菌移植后7天,分别收集新鲜小鼠粪便样品并称重。将200mg新鲜粪便样本溶于2ml无菌PBS中形成原液。原液涡旋5 min，对于涡旋不能分解的样品再用匀浆机匀浆至无明显大颗粒。用无菌PBS (或脑心浸液肉汤培养基)进行连续稀释，取1ml原液用9ml无菌PBS稀释制成一级稀释液，取1 ml一级稀释液用9 ml无菌PBS稀释形成二级稀释液，重复此步骤3-5次得到逐级稀释液，并将逐级稀释液分别接种在选择性培养基上培养18-24h后观察生长情况，以确定每克粪便中的细菌浓度。

移植前后小鼠粪便样本培养情况 A：移植前，粪便接种哥血，培养24h后无菌落生长 B：移植7天后，小鼠粪便原液10倍稀释，哥血培养24h后菌落 C：100倍稀释，哥血培养24h后菌落 D：10000倍稀释，哥血培养24h后菌落

无菌小鼠灌胃操作

按照物品无菌传递要求，将密封装有菌液样品的离心管传递进入隔离器内。

提前将8号或10号小鼠灌胃针和1 ml注射器经高温高压灭菌后，按照物品无菌传递要求传入无菌隔离器内。

用1ml注射器吸取菌液，将灌胃针与注射器相匹配。

打开笼盖，用右手拇指和食指提起小鼠尾巴中部，并将小鼠放置在笼盖上。

称量小鼠体重，根据小鼠体重进行灌胃，灌胃量约为10 μl/g。以体重平20 g无菌小鼠为例，小鼠灌胃的体积约200 μl，菌量约10^7-10^8 cfu。开管即用，未用完丢弃。

用左手拇指和食指第一、二指节抓住无菌小鼠耳后的颈部皮肤将其拎起，用无名指和小指夹其背部皮肤和尾部将其固定，同时应防止动物窒息。使其头、颈和身体呈直线。

灌胃针头从动物嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食管后会有刺空感。

将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，回抽注射器无空气逆流方可注入菌液。

观察动物的反应，如无过度挣扎，可尝试推注，如阻力较小可推注所有药物，如阻力过大或动物反应剧烈，呼吸受阻，可缓解后再进行灌胃操作。

松开动物，观察动物呼吸，如无呼吸异常，可确定灌胃成功。

为提高微生物移植效果，可用等量菌液对小鼠下腹部和背部皮肤进行涂抹 (以皮肤被毛浸湿为准)，小鼠可通过自身或相互舔舐摄取菌群；对于未断奶仔鼠的微生物移植，可在母鼠乳头部位涂抹菌液。

注：样本量根据具体实验方案和动物数量自行调整 (200 mg粪便/只/次)。常规菌群移植实验一周内灌胃2-3次 (致病菌除外) 可完成定植，仔鼠由于灌胃量较少，可灌胃3-5次完成定植。

细菌定植检测

无菌小鼠灌胃成功一周后，取粪便样本并留样进行16s rRNA测序或PCR检测。

将1 ml EP管高压灭菌后传入隔离器内。

粪便采集：双手进入隔离器后，固定小鼠，使其双手抓住笼盖，将其尾部提起，用手指轻轻按压小鼠下腹部，刺激小鼠排便，粪便样本放入对应编号的EP管中。

将EP管接口处使用封口胶封口后按照无菌传递物品要求，将其传出隔离器。

将装有样本的EP管立即至于-80 ℃保存。建议保存时间在3-6个月。

粪便样本和原始菌液同时进行16s rRNA测序或PCR检测，评估细菌定植情况。PCR分析，V3区或V6区多样性分析相似度达95%以上即定植成功。

无菌处理

灌胃针、1.5 ml离心管、15 ml离心管、纱布、滤筛等物品经60 min高温高压灭菌。

过氧乙酸（高效消毒剂）配制：

原液配制：将过氧乙酸A液和B液混合，在室温下静置过夜。

工作液：取原液用无菌水 (纯水经132 ℃，60 min高温高压灭菌) 稀释4倍，制成为过氧乙酸3%的稀释液。

使用方法：浸泡法/擦拭法/喷洒法

注意事项：1.过氧乙酸不稳定，应贮存于通风阴凉处，远离可燃物质。2、过氧乙酸对多种金属和织物有较强的腐蚀和漂白作用，金属制品与织物经浸泡消毒后，及时用符合要求的蒸馏水冲洗干净。3、接触过氧乙酸时，应采取防腐蚀的防护措施，科室应配备防护用品并正确使用。4、我院购入的实际消毒液浓度请注意参照说明书。

参考资料

Bárcena, C., Valdés-Mas, R., et al. (2019). Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nat Med 25(8): 1234-1242.

Faith, J. J., Ahern, P. P., et al. (2014). Identifying gut microbe–host phenotype relationships using combinatorial communities in gnotobiotic mice. Sci Transl Med 6(220): 220ra11-220ra11.

Lee, S. M., Donaldson, G. P., et al. (2013). Bacterial colonization factors control specificity and stability of the gut microbiota. Nature 501(7467): 426-429.

【相关资源】

名称：嗜黏蛋白阿克曼菌 | Akkermansia muciniphila

菌株编号：HZB366847, ATCC BAA-835, DSM 22959

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更新日期：2025-01-16

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