实验指南 | 放线菌、霉菌形态与菌落特征观察及酵母菌显微计数

一、实验目的

(1)认识霉菌、放线菌的形态特征及菌落特征。

(2)了解血球计数板的构造与原理，掌握用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、实验原理

1.霉菌的基本形态

霉菌不是分类学的名词，而是产生分枝菌丝的真菌的统称，意即“发霉的真菌”。它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不像蘑菇那样产生大型肉质的子实体。构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。

在显微镜下观察，霉菌菌丝是一种透明的胶管状的细丝，直径为3~10μm，比细菌和放线菌的细胞粗至几倍到几十倍。菌丝可伸长并产生分枝，菌丝细胞的分裂多在每条菌丝的顶端进行，前端分枝。许多分枝的菌丝相互交织在一起，为菌丝体。常见的菌丝体有白色褐色、灰色，或鲜艳的颜色。如毛霉疏松发达毛状的营养菌丝，初期为白色，后变为灰色或黑色:青霉的营养菌丝为无色或淡色的菌丝体，在气生菌丝上产生的多极帚状分枝的分生孢子梗顶端产生分生孢子，呈绿色、蓝色或黄色，致使各种青的菌落具有特有的颜色;黄曲霉菌落正面的颜色随着逐渐生长会由白色变为黄色、黄绿色，呈半绒毛状，孢子成熟后菌落颜色变为褐色。

菌丝可不断自前端生长并分枝，无隔或有隔，具有一个至多个细胞核。根据菌丝中是否存在隔膜，霉菌菌丝有无隔菌丝及有隔菌丝两种类型。无隔菌丝:菌丝中无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含有多个细胞核。这是低等真菌(即鞭毛菌亚门和接合菌亚门中的霉菌)所具有的菌丝类型。有隔菌丝:菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝体由很多个细胞组成，每个细胞内有1个或多个细胞核。在隔膜上有1至多个小孔，使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互流通。这是高等真菌(即子囊菌亚门和半知菌亚门中的霉菌)所具有的菌丝类型。

为有效地摄取营养、适应环境、满足生长发育的需要，霉菌菌丝具有营养菌丝和气生菌丝的分化。在固体基质上生长时，部分菌丝深入基质吸收营养，称为基质菌丝或营养菌丝向空中伸展的称为气生菌丝。许多霉菌的菌丝可以分化成一些特殊的形态和组织，即菌丝变态。锈菌、霜霉菌和白粉菌等专性寄生霉菌的菌丝上产生出分枝，侵入细胞内分化成根状指状、球状和佛手状等的“吸器”，用以吸收寄主细胞内的养料;根霉属霉菌的菌丝与营养基质接触处分化出“假根”，有固着和吸养料的功能;某些捕食性霉菌的菌丝变态形成“菌环”或“菌网”，用于捕捉其他小生物如线虫、草履虫等;药用的茯苓、麦角等由大量菌丝集聚成紧密的休眠体“菌核”，其外层组织坚硬，颜色较深;内层疏松，多呈白色。

一般霉菌通过产生无性孢子和有性孢子两种方式繁殖。霉菌气生菌丝进一步发育为繁殖菌丝，产生孢子。无性孢子和有性孢子的特征及菌丝特征是霉菌分类鉴定的重要依据。霉菌在固体基质中生长发育形成的菌落特征是其菌丝体及孢子体特征的综合反映。气生菌丝间没有毛细管水，霉菌菌落外观较干燥、质地疏松、大而不透明，呈现绒毛状、棉絮状或蛛网状，不易挑取，菌落正反面颜色及构造等常不一致。

霉菌制片在显微镜下形态特征的观察须着重注意菌丝体分化出的特化结构、菌丝的大小、菌丝隔膜的有无、无性繁殖及有性繁殖产生的孢子类型、着生方式等。如根霉具有假根、匍匐菌丝、孢子囊梗、孢子囊、囊轴、菌丝无隔等特征(图1):曲霉营养菌丝有隔分生孢子梗无隔，具有顶囊和足细胞(图2、图3);青霉菌丝和分生孢子梗有隔，具有帚状分枝(图4)。

图1、根霉的显微形态

图2、曲霉显微形态

图3、曲霉显微形态

图4、青霉显微形态

2.放线菌的基本形态

放线菌(aetinomycele)属于原核生物类群、细菌界，具有分支状菌丝体，革兰氏染色为阳性。放线菌只是形态上的分类，因菌落呈放线状而得名。在自然界广泛分布，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。结构与细菌相似，具有细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核等基本结构。个别种类的放线菌也具有细菌鞭毛样的丝状体，但一般不形成荚膜、菌毛等特殊结构。放线菌的孢子在某些方面与细菌的芽孢有相似之处，都属于内源性孢子，但细菌的芽孢仅是休眠体，不具有繁殖作用，而放线菌产生孢子则是一种繁殖方式。

放线菌菌体由菌丝体构成，其菌丝有基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝和孢子丝三种类型。基内菌丝(substrate mycelium)是放线菌孢子落在固体基质表面，吸收水分肿胀、萌芽，向基质四周表面和内部伸展形成的菌丝，又称营养菌丝(vegetativemycelium)直径为0.2~0.8μm，色淡，主要功能是吸收营养物质和排泄代谢产物。气生菌丝(aerialmyeelium)是基内菌丝长出培养基外并伸向空间的菌丝(图5)。一般气生菌丝颜色较深菌丝较粗，直径为1.0~1.4μm，形状直伸或弯曲，可产生色素。孢子丝(sporehypha)是气生菌丝发育到一定程度，通过细胞膜内陷或细胞壁和细胞膜同时内缩、缢缩进行横隔分裂在顶端分化出孢子的菌丝。不同放线菌孢子丝的形态及其在气生菌丝上的排列方式不同。常见的孢子丝有直形、波曲、钩状、螺旋状等，呈对生、互生、丛生或轮生。孢子形状不一其表面光滑或褶皱，疣状、刺状、毛发状或鳞片状，形状比较稳定，是菌种分类、鉴定的重要依据。

图5、放线菌显微形态

不同放线菌菌落形态具有一定差异，多数放线菌在固体基质上进行基内菌丝、气生菌丝、孢子丝的分化。气生菌丝在空间伸展、顶端产生干粉状孢子。菌丝间没有毛细管水存积，使放线菌形成的菌落干燥、不透明，表面丝绒状，上罩薄层干粉，菌落难以挑起，正反颜色常不一致。

3.血球计数板的构造与计数原理

血球计数板是一种常用的细胞计数工具，常用来计数红细胞、白细胞以及较大单细胞微生物如酵母细胞、霉菌孢子等的数量，但不便于对形态微小的细菌等样品进行计数。细菌细胞计数可采用 Helber型细菌计数板进行准确的计数。

血球计数板由精密厚玻璃制成。四条平行槽将计数板隔成三个平台，中间较宽的平台比两侧平台下陷0.1mm，并被一短槽隔成两半。其每边平台各刻有一个同样大小的方格网,在两侧平台上加盖盖玻片后，中间平台深度0.1mm，中央大方格长1mm、宽1mm，体积为0.1mm³，容积为十的负四次方毫升，即为计数室。

计数室分为两种类型，如图6所示。一种是25x16型的汤麦式，计数室内分为25个中格，每一个中格又分为16个小格:另一种是16x25型的希利格式计数室，中央大方格分为16个中格，每一个中格又分为25个小格。无论哪种规格，计数室的小方格数均为400个。计数时，先计得若干个中格中的细胞数，除以这些中格包含的小格数，得到每个小格中的平均细胞数，再乘以400得到整个计数室中的细胞数，计数室的容积是十的负四次方毫升所以再除以计数室的容积数、乘以稀释倍数，即可得到每毫升菌液中所含有的微生物细胞数。

图6、雪球计数板的构造

计数原则:位于大方格或中格边线上的细胞，数左不数右、数上不数下。对酵母细胞计数，如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。若各中格的细胞数相差不大，表明菌悬液较为均匀，数据可以使用。此法计得的微生物细胞数是死菌细胞数与活菌细胞数的总和。若要区分计数死菌与活菌值，应采用活体染色法以示区分。

三、实验器材与试剂

1.实验仪器

普通光学显微镜、血球计数板、手动计数器。

2.微生物材料

(1)装片:青霉、曲霉、根霉、链霉菌

(2)啤酒酵母菌液。

3.实验用具

载玻片、盖玻片、胶头滴管、洗瓶、擦镜纸。

四、实验内容与方法

1.酵母菌的显微计数

(1)稀释:将啤酒酵母菌悬液用无菌水进行适当稀释。

(2)镜检计数室:在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物则需清洗

(3)加样品:在清洁干燥的血球计数板上盖上盖玻片。用细口滴管吸取振荡均匀的啤酒酵母菌稀释液，对准盖玻片边缘，轻挤胶头，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，让计数室刚好充满菌液。注意不可有气泡，每次吸液前都要振荡均匀!

(4)显微镜计数:将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜(40x)观察。静置1min后进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再做计数。

(5)显微镜计数方法:样品稀释度要求每中格内有10~20个菌体为宜。

①16x25 型计数板:取左上、右上、左下、右下四个角上的中方格(共4个中格，100个小格)内的细胞逐一进行计数

②25x16 型计数板:取左上、右上、左下、右下四个中方格外，还需加数中央的一个中方格(共5个中格，80个小格)内的细胞。

③记录各中方格的细胞数量，如各中格的细胞数相差不大，表明菌悬液比较均匀，数据可以使用。重复1~2次实验过程，取平均值，按下列公式计算每毫升菌液中的酵母菌细胞数。

(6)清洗血球计数板:

计数完毕后，随即将血球计数板用洗瓶冲洗，亦可用棉花擦洗，切勿用硬试管刷洗刷。洗完后用蒸馏水冲洗一遍，斜置晾干或用滤纸吸干。

2.霉菌的基本形态及菌落特征观察

观察青霉、曲霉、根霉的基本形态及菌落特征。注意观察菌丝(形状、有无隔膜)、菌丝变态(假根、匍匐菌丝、孢子穗、孢子囊、接合孢子囊)等基本形态特征。

(1)青霉:分生孢子梗、小梗和分生孢子。

(2)曲霉:分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子。

(3)黑根霉:假根、匐菌丝、孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和结合孢子

(4)产黄青霉、黑根霉的菌落特征观察。

3.放线菌的形态及菌落特征观察

观察链霉菌基内菌丝与气生菌丝的分布、粗细及色泽的差异、孢子丝、分生孢子。观察泾阳链霉菌及灰色链霉菌的菌落特征。

五、实验结果与讨论

(1)绘制青霉、曲霉、根霉的显微特征结构。

(2)绘制放线菌--链霉菌装片的显微特征结构。

(3)描述记录产黄青霉、黑根霉、泾阳链霉菌及灰色链霉菌的菌落特征。

(4)记录计数结果，根据你的实验体会，说明血球计数板计数的误差主要来自哪些方面。

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更新日期：2024-05-11