实验指南 | 微生物的接种方法

引言

在无菌条件下， 用接种环或接种针挑取微生物， 把它由一个培养器皿转接到另一个接种器皿中进行培养， 是微生物学研究中最常用的基本操作。 微生物接种应在火焰附近进行操作或在无菌操作箱或无菌室内进行。 进行微生物接种时常使用的工具有: 接种环、接种针和涂布器， 移取液体培养物时可使用无菌吸管或移液枪。 常用的微生物接种方法包括以下几种。

一、 平板划线接种法 (分离培养法)

平板划线接种法是微生物分离培养的常用技术， 其目的是将混杂的微生物在琼脂平板表面充分地分散开， 使单个微生物能固定在一点上生长繁殖， 形成单个菌落， 以达到分离纯种的目的。 平板划线接种法是用接种环以无菌操作蘸取少许待分离的材料， 在无菌培养平板表面进行平行划线、 扇形划线或其他形式的连续划线， 其中以分段划线和连续划线法较为常用。

1.分区划线接种法 (分段划线接种法)

（1）右手拿接种环， 通过酒精灯烧灼灭菌， 冷却后， 从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中蘸取少量菌样。 左手抓握琼脂平板 (让皿盖留于桌上)， 在酒精灯火焰左前上方， 使平板面向火焰， 以免空中杂菌落入。 用蘸过菌的接种环在平板培养基的一边涂抹面积约0.5㎡区域， 作为原始区， 并将接种环上剩余的菌烧掉。 待接种环冷却后， 通过原始区进行密集而不重叠的来回划线， 面积约占整个平板的1/4左右， 此为第1区。 划线时接种环与琼脂平板呈 40°~45°角轻轻接触， 利用腕力滑动， 切忌划破琼脂。

（2）转动培养皿约90°， 并将接种环上多余的细菌进行烧灼灭菌， 待冷后， 压1区末端的2~3条线， 划下一区域 (约占1/4面积)， 此为第2区。

（3）第2区划完后可不烧灼接种环 (每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定)， 用同样方法划第3区、 第4区， 划满整个平皿 (图1)。

（4）划线完毕，将平板扣入皿盖，并做好标记，置37℃培养箱培养18~24h， 观察琼脂表面菌落分布情况， 注意是否分离出单个菌落， 并记录菌落特征 (如大小、 形状、 透明度、 色素等)。

图1 分区划线接种法

2.连续划线接种法

用接种环以无菌操作蘸取少许待分离的材料， 在无菌平板表面作连续的平行划线(图2)。划线完毕后，盖上皿盖，并做好标记，置于37℃培养箱中培养18~24h，观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征(如大小、形状、透明度、色素等)。

图2 连续划线接种法

二、涂布平板接种法

涂布平板接种法是微生物学研究中常用的纯种分离方法。涂布平板接种法是先将已融化的培养基导人无菌培养皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的待分离样品的悬液滴加在平板表面，用无菌涂布耙(或涂布棒)将菌液均匀分散至整个平板表面(图3)，经培养后挑取单个菌落。

图3 涂布平板接种法

三、稀释倒平板法

将待分离的材料用无菌水进行一系列的稀释(1:10、1:100、1:1000、…)，分别取不同的稀释液少许，对号放人已灭菌的培养皿中，然后再倒入已融化并冷却至50℃左右的琼脂培养基，边倒入边混匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，待琼脂凝固成平板后置于37℃培养箱中培养18~24h，观察琼脂表面菌落形成情况(图4)。

图4 稀释倒平板法

四、液体培养接种法

把微生物移植于液体培养基的接种方法称作液体接种法。在进行微生物生理生化测定和微生物发酵实验研究时，常使用液体接种法。液体接种法可以观察微生物不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。

1.斜面菌种接种于试管或小三角瓶中的液体接种方法

用接种环以无菌操作挑取斜面菌种一至几环，将接种环在接近液面的管壁上轻轻研磨，并蘸取少许液体与之调和，使菌体均匀混合于液体培养基中。在接种量大时，也可取适量无菌水加人斜面菌种试管中，用接种环将菌苔洗下，制成菌悬液，再把菌悬液接种于液体培养基中。将接种后的液体培养基放人37℃培养箱孵育18~24h，取出观察生长情况。

2.液体菌种接种于液体培养基中的接种方法

进行微生物发酵实验时，一般用无菌移液管或无菌移液器吸取一定量的菌液接种至盛有液体培养基的摇瓶中(图5)。将摇瓶放人37℃振荡培养箱中培养18~24h，取出观察生长情况。

图5 液体菌种接种法

五、穿刺接种法

在进行保存菌种或检查细菌的运动能力时常使用穿刺接种法。

穿刺接种的方法是:取已灭菌新鲜的半固体柱状培养基，用接种针以无菌操作挑取单个菌落后，从培养基中心部位垂直自上而下刺入，直至接近管底(不要穿透培养基)再循原路退回，进行穿刺接种。接种后将试管置于37℃培养箱中培养18~24h，取出后观察穿刺线上细菌生长情况，若细菌向穿刺线周围扩散生长，说明细菌具有运动能力。

六、斜面接种法

斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌苔转接至另一新鲜斜面培养基上，目的是扩大纯种细菌及实验室保存菌种。斜面接种的方法(图6)，包括以下几种方法。

1.点种法

以无菌操作法用接种环挑取少量菌苔，点种在斜面培养基的中下部，此法常用于霉菌孢子的接种，也可用于暂时保存菌种。

2.直线接种法

以无菌操作法用接种环挑取少量菌苔于斜面底部，至下向上划一条直线，用于观察菌体培养特征。

3.曲线接种法

以无菌操作法用接种环挑取少量菌苔于斜面底部，至下向上划一条直线，再自下而上轻轻来回作蜿蜒划线，或直接自斜面底部向上蜿蜒划线。此法能充分利用斜面，获得大量菌体细胞，是进行菌种保存时常用的接种方法。

微生物接种操作注意事项:

在进行微生物培养过程中，标本的采集或培养操作等均须严格执行无菌操作技术。

(1)所有用具，培养基等必须严格灭菌，使用过程中不得与外界未经灭菌物品接触如已接触应立即换用。切忌长时暴露于空气中，有盖的应迅速盖上。

(2)整个操作过程均须在无菌室、超净工作台或接种罩内进行。

图6 斜面培养基接种法

(3)灭菌的试管、摇瓶在打开盖后关闭前，口部应在火焰上通过1~2次，以杀灭可能从空气中落入的杂菌。

(4)接种环或接种针于每次使用前，均应在火焰上彻底烧灼灭菌，金属棒或玻璃棒部分亦须转动着通过火焰3次。

(5)皮肤表面及口腔常存在大量杂菌，故在操作过程中切忌用手接触标本及已灭菌的器材内部，也勿用口吹。

(6)打开瓶塞及试管塞时，应将棉塞或试管帽上端夹持于手指间适当位置，不得将棉塞或瓶塞任意放置别处。

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更新日期：2024-05-09